胃損傷修復(fù)中骨髓干細(xì)胞的作用

孔　淵　牛　惠　劉　馨

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧　錦州　121000)

?

胃損傷修復(fù)中骨髓干細(xì)胞的作用

孔淵牛惠劉馨

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的探討骨髓干細(xì)胞在急性胃損傷修復(fù)過程中的定植及作用。方法在綠色熒光蛋白鼠骨髓移植模型基礎(chǔ)上，通過化學(xué)誘導(dǎo)造成小鼠胃部急性損傷，刺激干細(xì)胞參與組織自我修復(fù)。結(jié)果模型15例中有11例綠色熒光蛋白鼠骨髓成功定植在損傷，最終死亡2例(P<0.05)。結(jié)論骨髓干細(xì)胞在胃損傷修復(fù)過程中參與定植和分化并參與組織的自我修復(fù)，該方法是預(yù)防治療胃損傷和遺傳性胃部疾病的一種理想方法。

〔關(guān)鍵詞〕骨髓干細(xì)胞；消化道病變；損傷；自我修復(fù)

近年來國內(nèi)外已有許多關(guān)于骨髓移植治療血液病、肝硬化、心肌梗死等疾病的臨床研究〔1～4〕，骨髓干細(xì)胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力，而但在消化道疾病治療中暫屬空缺。本實(shí)驗(yàn)旨在探究骨髓干細(xì)胞在胃損傷修復(fù)中的定植與作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠購自遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心，SPF級(jí)條件飼養(yǎng)；綠色熒光蛋白(GFP)小鼠購自遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心，清潔級(jí)條件飼養(yǎng)。

1.1.2試劑白消安和CD34-PE單抗購自美國Santa Cruz公司，環(huán)磷酰胺(TXT)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥，紅霉素和慶大霉素購自利君制藥，蘇木精-伊紅(HE)染液購自珠海貝索生物有限公司，無水乙醇購自天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

1.1.3儀器流式細(xì)胞儀(BD FACSVantage SE，美國BD公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-10C，上海安亭科學(xué)儀器廠)，石蠟包埋機(jī)(KD-BMⅢZ，浙江金華科迪有限公司)，石蠟病理切片機(jī)(Leica RM2235，德國Leica公司)，熒光倒置顯微鏡(OLYMPLUS IX51，日本OLYMPLUS公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組選取雌雄各半、約10周齡、體重為(25±5)g的SPF級(jí)C57BL/6小鼠50只及清潔級(jí)GFP鼠10只，其中隨機(jī)選取C57BL/6小鼠25只作為對(duì)照組，其余25只作為化學(xué)誘導(dǎo)組。

1.3骨髓移植動(dòng)物模型的制備對(duì)照組與化學(xué)誘導(dǎo)組采取白消安及TXT聯(lián)合化療，建立小鼠骨髓移植受體模型。用無菌蒸餾水將白消安稀釋為400 mg/ml濃度，按照4 mg/kg的劑量，通過灌胃針給C57小鼠灌胃，1次/d，持續(xù)4 d，第5天起用無菌生理鹽水將TXT稀釋為500 mg/ml濃度，按照50 mg/kg的劑量，通過尾靜脈注射C57小鼠，1次/d，持續(xù)3 d。用藥結(jié)束后，以小鼠通過體重測(cè)量化療前后減輕10%及血常規(guī)檢查各系血細(xì)胞明顯降低者為骨髓抑制標(biāo)準(zhǔn)，選取其中造模成功的30只小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和化學(xué)誘導(dǎo)組。

1.4骨髓干細(xì)胞的獲取及CD34陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)隨機(jī)抽取GFP小鼠4只，頸椎脫臼處死后，在75%酒精中浸泡消毒10 min，在超凈工作臺(tái)中使用無菌剪刀分離出股骨和脛骨，剪開兩骺端，用1 ml注射器吸取DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔至髓腔發(fā)白。用1 ml移液器反復(fù)吹打沖出的培養(yǎng)基，形成骨髓單細(xì)胞懸液，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞加入30 μl小鼠血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，加入10 μl PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD34抗體，對(duì)照管加入相應(yīng)的陰性抗體，4℃避光反應(yīng)30 min，加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，作用5 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞2次，上機(jī)檢測(cè)。

1.5骨髓干細(xì)胞移植通過CD34陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將骨髓單細(xì)胞懸液重新調(diào)整濃度為3×107/ml，化療結(jié)束后12 h通過尾靜脈注射骨髓單細(xì)胞懸液，注射體積為0.3 ml，共計(jì)1×107個(gè)細(xì)胞，移植72 h后，再次注射入相同數(shù)量的細(xì)胞。骨髓移植前后均隔離飼養(yǎng)，添加250 mg/L紅霉素和320 mg/L慶大霉素的飲水，防止感染。

1.6小鼠胃黏膜損傷模型骨髓移植2 w后，對(duì)照組小鼠在0、2、4、6 d采取空腹灌胃蒸餾水0.3 ml，1次/d；化學(xué)誘導(dǎo)組在0、2、4、6 d采取空腹灌胃75%無水乙醇0.3 ml，1次/d。造成小鼠胃黏膜損傷模型。

1.7受體小鼠骨髓GFP陽性細(xì)胞鑒定酒精灌胃后，正常飲食飼養(yǎng)7 d后頸椎脫臼處死小鼠，分離股骨和脛骨，將骨髓干細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液，取1×106個(gè)細(xì)胞用PBS沖洗2次，同法獲取正常的C57BL/6及GFP小鼠骨髓的單個(gè)細(xì)胞懸液，作為陰性對(duì)照管及陽性對(duì)照管，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8消化道組織病理學(xué)檢查將脫臼處死的小鼠解剖取胃，沿胃大彎側(cè)剪開，用冷生理鹽水漂洗胃內(nèi)容物，將胃壁展平固定在平臺(tái)上，在解剖顯微鏡下觀察胃黏膜的損傷情況，經(jīng)過脫水固定后切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1骨髓有核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例隨機(jī)抽取GFP鼠，通過無菌操作獲取小鼠骨髓，經(jīng)過處理獲取單細(xì)胞懸液，采用CD34-PE抗體特異性標(biāo)記，與CD34-PE陰性對(duì)照管用流式細(xì)胞儀上機(jī)測(cè)定，獲取GFP鼠骨髓中的CD34陽性細(xì)胞數(shù)，通過CD34陽性細(xì)胞數(shù)確定骨髓移植骨髓干細(xì)胞數(shù)目(1.08%)。

2.2GFP陽性細(xì)胞在受體小鼠骨髓中定植正常GFP鼠骨髓干細(xì)胞中GFP陽性細(xì)胞占比為97.26%，經(jīng)骨髓移植后定植在C57BL/6骨髓移植受鼠的GFP鼠骨髓中GFP陽性細(xì)胞數(shù)占88.35%，較GFP陰性對(duì)照管GFP陽性細(xì)胞數(shù)(0.86%)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.3GFP骨髓干細(xì)胞在受損消化道定植化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)束1 w后解剖對(duì)照組和化學(xué)誘導(dǎo)組小鼠，熒光倒置顯微鏡鏡下觀察病理組織切片，對(duì)照組小鼠HE染色下，胃黏膜無病理變化，僅黏膜下小血管中有GFP表達(dá)；化學(xué)誘導(dǎo)組中小鼠胃黏膜層中有大量炎癥細(xì)胞浸潤，胃黏膜上皮細(xì)胞中有GFP表達(dá)，化學(xué)誘導(dǎo)小鼠15例，其中11例胃黏膜層有GFP表達(dá)，死亡2例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：對(duì)照組；B：對(duì)照組熒光顯微鏡下僅血管中有GFP陽性細(xì)胞；C：化學(xué)誘導(dǎo)組，黏膜層可見大量炎性細(xì)胞浸潤；D：化學(xué)誘導(dǎo)組熒光顯微鏡下可見大量GFP陽性細(xì)胞圖1　胃病理切片(HE)

3討論

骨髓干細(xì)胞具有多向分化潛能、造血支持、促進(jìn)干細(xì)胞植入和自我修復(fù)等特點(diǎn)，骨髓干細(xì)胞因處于未定向分化和強(qiáng)增殖能力狀態(tài)下，在合適的條件或信號(hào)下可分化增殖成不同類型、不同功能、不同形態(tài)的組織干細(xì)胞〔5〕，進(jìn)一步參與組織自我修復(fù)等為骨髓治療提供可能，受到國內(nèi)外的學(xué)者關(guān)注，已有通過骨髓移植治療血液病、肝硬化、心肌梗死、擴(kuò)張型心肌病、心功能衰竭、糖尿病等疾病的臨床研究〔6～9〕。在骨髓移植治療中，CD34細(xì)胞作為篩選、計(jì)數(shù)骨髓干細(xì)胞的標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于臨床，CD34細(xì)胞可以參與骨髓干細(xì)胞的運(yùn)輸、定植等〔10，11〕。

消化道疾病是由多因素參與的多發(fā)常見病，總發(fā)病率占人口的20%左右，消化道腫瘤占癌癥發(fā)病率的43.3%，其中胃癌占消化道腫瘤發(fā)病率一半，胃疾病如不及時(shí)治療，進(jìn)展速度快，極易轉(zhuǎn)化為癌癥，慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃息肉、殘胃炎等都可轉(zhuǎn)變成胃癌。

本研究發(fā)現(xiàn)，消化道黏膜更新速度快，平均7 d更新一次，為骨髓移植治療消化道疾病提供可能，本研究發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞移植參與胃損傷疾病修復(fù)，當(dāng)胃黏膜受到刺激發(fā)生損傷時(shí)，骨髓干細(xì)胞可定向轉(zhuǎn)化為胃干細(xì)胞，定植于受損部位，定向分化為主細(xì)胞和壁細(xì)胞等胃黏膜組織，參與組織的自我修復(fù)，形成新的胃黏膜組織，說明骨髓干細(xì)胞移植對(duì)胃損傷有臨床治療意義，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1Saito T，Tomita K，Hagh H，etal.Bone marrow cell-based regenerative therapy for liver cirrhosis〔J〕.World J Methodol，2013；3(4)：65-9.

2Tomita S，Lir K，Weiselr D，etal.Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function〔J〕.Circulation，1999;100(Supplement 2)：Ⅱ-247-Ⅱ-56.

3Luthe S，Juns J，Wessenm K，etal.Bone marrow side population cells are enriched for progenitors capable of myogenic differentiation〔J〕.J Cell Sci，2008;121(Pt 9)：1426-34.

4劉媛，劉毓剛，吳麗娟，等.流式細(xì)胞術(shù)干祖細(xì)胞分類計(jì)數(shù)在自體造血干細(xì)胞移植治療惡性血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用〔J〕.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011;32(20)：2310-2.

5施昱晟，顧鳴敏.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景〔J〕.診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2012;11(3)：312-6.

6何瓊，朱隴東，陳紅.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在大鼠急性肝損傷組織中的定植能力〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009;13(23)：4437-42.

7李彥林，韓睿，王福科.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨及軟骨組織工程中的應(yīng)用〔J〕.中國臨床康復(fù)，2006;10(5)：124-5.

8呂鐵偉，田杰，朱靜，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的初步實(shí)驗(yàn)觀察〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003;28(4)：463-7.

9田文，曾定尹，Michael K，等.骨髓動(dòng)員對(duì)骨髓造血干細(xì)胞在心肌梗死后心臟中定植及分化的影響〔J〕.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009;3(7)：304-10.

10劉艷榮，陳珊珊，于弘.流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)CD34陽性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2000;8(4)：302-5.

11程昊鈺，何明生，王延華，等.綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠CD34_脊髓全橫斷大鼠模型中的存活及遷移〔J〕.中國病理生理雜志，2007;23(3)：579-83.

〔2015-12-21修回〕

(編輯滕欣航)

基金項(xiàng)目：遼寧省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014410004)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金項(xiàng)目

通訊作者：劉馨(1977-)，男，副教授，副主任檢驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床腫瘤標(biāo)記物研究。

〔中圖分類號(hào)〕R39

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2067-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.008

第一作者：孔淵(1988-)，男，在讀碩士，主要從事臨床腫瘤標(biāo)記物研究。