高血壓腦出血患者外周血單個核細胞中P38 MAPK的表達

李彥明　姜　紅　徐勝東　劉　娟

(寧夏醫科大學，寧夏　銀川　750004)

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高血壓腦出血患者外周血單個核細胞中P38 MAPK的表達

李彥明姜紅徐勝東1劉娟

(寧夏醫科大學，寧夏銀川750004)

〔摘要〕目的探討P38 MAPK在高血壓腦出血外周血單個核細胞中的表達情況及其臨床意義。方法選擇寧夏醫科大學總醫院神經外科確診的高血壓腦出血患者50例作為實驗組，在發病后1、3、7、14 d分別抽取靜脈血，用PCR熒光檢測法測定P38 MAPK mRNA的表達，同時ELISA檢測外周血IL-6/8含量，與正常體檢者(25例，對照組)對比，并分析表達意義。結果實驗組患者外周血單個核細胞核內P38 MAPK mRNA表達和血清IL-6/8含量均高于正常體檢者(P<0.05)，病情越重，P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量越高，在腦出血后3 d時P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量達到高峰，此后表現為下降趨勢，P38MAPK mRNA及IL-6/8含量之間呈正相關(P<0.05)。結論P38 MAPK、IL-6、IL-8參與了高血壓腦出血的炎癥反應，與腦出血后腦組織損傷機制相關。

〔關鍵詞〕P38絲裂素活化蛋白激酶；高血壓；腦出血；白細胞介素-6；白細胞介素-8

細胞因子和炎性介質與出血性腦血管病的組織損傷關系密切，如白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子等〔1〕。本研究通過評價急性高血壓腦出血患者外周血單個核細胞P38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)及IL-6、IL-8表達情況，分析三者之間相關性，進一步探討其對高血壓腦出血炎性損傷的作用。

1資料與方法

1.1研究對象采集2014年3月至2015年2月寧夏醫科大學總醫院神經外科收治的高血壓腦出血患者50例，男29例，女21例，年齡36～68〔平均(54.2±10.2)〕歲。病程1～24 h，平均(11.2±3.2)h，按Glasgow-pittsberg昏迷評分，分為輕癥(26～35分)15例，中癥(21～25分)16例，重癥(14～20分)19例。在門診隨機挑選健康體檢者25例作為對照組，男13例，女12例，年齡38～69〔年齡(53.7±10.1)〕歲。納入標準〔2〕：年齡小于70歲，為首次出血并經CT和腦血管造影證實，且符合第四屆全國腦血管病會議制定的診斷標準。排除標準：腦動脈瘤破裂出血者；外傷性出血；顱內腫瘤出血；腦疝晚期(雙側瞳孔散大)者；合并急慢性炎癥以及嚴重肝腎疾病或其他原因致出、凝血指標異常者。

1.2主要試劑及儀器人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司，中國)，熒光檢測試劑：GoTaq?qPCR(Promega公司，美國)，P38 MAPK及內參照磷酸-3-甘油醛脫氫酶(GAPDH)擴增引物(Biosail公司，加拿大)，低溫高速離心機5417R(Eppendorf公司，美國)，7900 RT-PCR儀(ABI公司，美國)，IL-6/IL-8試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，中國)；酶標儀(Benchmark，德國)。

1.3方法

1.3.1引物的設計P38 MAPK及內參GAPDH的引物由加拿大的Biosail公司設計并合成，P38 MAPK上游：5′-AAGTTCCTGTCCACATTGCC-3′，下游：5′-TGGATTCAGTGTCAAGCTGC-3′，產物長度398 bp；GAPDH上游：5′-TCAACAGCGACACCCACTCC-3′，下游：5′-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3′，產物長度126 bp。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測采集高血壓腦出血患者發病后1、3、7、14 d的外周靜脈血3～5 ml，肝素鈉抗凝處理，分離出外周血單個核細胞。常規用Trizol提取各組外周血單個核細胞總RNA，按說明書逆轉錄合成cDNA，使用 GoTaq?qPCR進行熒光檢測，整個PCR反應體系如下：2倍的GoTaq?qPCR Master Mix、樣本cDNA 0.2 μg、雙蒸水，建立總體積40 μl的反應體系。反應條件：96℃ 2 min，96℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s，連續40個循環。“Ct值倒數” 法計算樣本cDNA相對含量，即p38 MAPK cDNA相對含量= p38 MAPK Ct值倒數/GAPDH Ct值倒數。

1.3.3外周血IL-6、IL-8的檢測采集高血壓腦出血患者發病后1、3、7、14 d的外周靜脈血3～5 ml，運用ELISA法檢查，步驟參照試劑使用說明進行外周血IL-6、IL-8的檢測。

1.4統計學方法應用SPSS18.0軟件行t檢驗，相關性采用Spearman分析。

2結果

見表1，表2。腦出血患者外周血單個核細胞核內P38 MAPK mRNA表達與IL-6、IL-8含量高于對照組(P<0.05)，在腦出血后3 d時P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量達到高峰，此后表現為下降趨勢。隨著病情的加重，P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量越高(P<0.05)。P38 MAPK mRNA表達量和IL-6呈正相關(r=0.79，P<0.05)；P38 MAPK mRNA表達量和IL-8的濃度呈正相關(r=0.84，P<0.05)；血清IL-6濃度和IL-8的濃度呈正相關(r=0.85，P<0.05)。

表1　實驗組與對照組P38 MAPK mRNA表達與

與對照組比較：1)P<0.05

表2　不同病情P38 MAPK mRNA表達與IL-6、IL-8

與對照組比較：1)P<0.05；與輕癥比較：2)P<0.05

3討論

高血壓腦出血后的損傷機制復雜，血腫的占位效應以及血腫對腦組織的直接破壞作用影響著預后。腦出血后多種血液成分被激活，其中包括重要的IL等炎性細胞因子，直接參與出血后損傷的炎性反應〔3〕。

MAPKs是胞內信號傳導的重要通路，是多個信號傳遞的交點和共同通路，細胞質內分布廣泛，將細胞外刺激信號傳遞至細胞核內，影響著細胞增殖、分化和應激調控〔4〕。三級激酶級聯傳遞信號，即MKKK、MKK、MAPK，是該家族信號傳導的共同特點。P38是MAPKs家族中重要一員，具有α，β，δ和γ四個亞型，其中p38α與炎癥反應關系密切。近些年，P38對炎性反應介入的發病影響的研究較為廣泛，研究顯示其具有細胞免疫調節、炎癥反應調控的重要作用，在生物學刺激下經過磷酸化等激活，在細胞核等重要部位發揮作用〔5〕。陸兆雙等〔6〕研究證明p38MAPK通過介導IL-6和IL-8的基因轉錄和翻譯，調節細胞因子合成。

本研究結果提示P38 MAPK mRNA及IL-6/8不僅參與了腦出血后的炎性反應的發生，而且對炎性反應的發展起到促進作用。在腦出血后3 d時P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量達到高峰，此后表現為下降趨勢，提示高血壓腦出血后炎性損傷機制〔7，8〕：腦出血急性期，血液分解物誘發腦組織炎癥反應的發生，血腫周圍分泌多種細胞因子，促進腦組織水腫發展，促進腦組織細胞的損傷；上述的細胞因子、化學因子可能會破壞血腦屏障，進而導致腦水腫，這也是外周血中炎性因子被檢測的病理生理基礎；并且外周血中炎性因子的表達促進了腦水腫的發展；炎性反應的發生，激活機體免疫系統，從而病情越重，炎性細胞因子釋放越多，炎性免疫反應就越強烈，腦組織細胞損傷越重。劉緒宏等〔9〕研究采用往動物中樞注入致病因子的方式，結果顯示外周血中炎性因子高于腦組織本身。

綜上所述，P38 MAPK可能在高血壓腦出血的發生和發展中發揮重要作用，且參與了腦組織的損害，通過一系列的信號轉導，激活IL-6、IL-8等炎癥因子的釋放，進一步加重高血壓腦出血后炎癥反應。

4參考文獻

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2張明偉，彭俊，劉陽，等.高血壓腦出血患者血清和顱內血腫液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量研究〔J〕.中華神經外科疾病研究雜志，2010；9(2)：138-41.

3Matsushita K，Meng W，Wang X，etal.Evidence for apoptosis after intercerebral hemorrhage in rat striatum〔J〕.J Cere Blood Flow Metab，2000；20(2)：396-404.

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6陸兆雙，范曉云，陳冰，等.多聚左旋精氨酸通過 p38/MAPK 信號通路誘導NCI-H292 細胞分泌 IL-6、IL-8的研究〔J〕.安徽醫科大學學報，2014；49(12)：1693-6.

7Hua Y，Wu J，Keep RF，etal.Tumor necrosis factor-alpha increases in the brain after intracerebral hemorrhage and thrombin stimulation〔J〕.Neurosurgery，2006；58(3)：542-50.

8李改麗，汪丙昂，張守信，等.實驗性大鼠腦出血灶周圍內細胞因子IL-1β的表達〔J〕.中華神經外科疾病研究雜志，2005；4(6)：532-5.

9劉緒宏，李柱一，劉煜，等.重癥肌無力乙酰膽堿受體抗體致中樞損害時IL-6水平的研究〔J〕.武警醫學，2000；11(4)：195-8.

〔2015-12-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學基金項目(No.81460214)

通訊作者：劉娟(1970-)，女，博士，教授，主要從事基礎醫學研究。

〔中圖分類號〕R33

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2084-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.016

·心、腦血管及代謝性疾病·

1濟源市婦幼保健院(濟源市婦女兒童醫院)

第一作者：李彥明(1979-)，男，碩士，講師，主要從事基礎醫學教學及科研研究。