遠隔缺血時處理對心臟瓣膜置換術心肌微小RNA表達及心肌細胞凋亡的影響

邢　杰　謝　霆　吳朝光

(海南省人民醫院心臟外科，海南　海口　570311)

?

遠隔缺血時處理對心臟瓣膜置換術心肌微小RNA表達及心肌細胞凋亡的影響

邢杰謝霆吳朝光

(海南省人民醫院心臟外科，海南海口570311)

〔摘要〕目的探討遠隔缺血時處理對心臟瓣膜置換術心肌微小RNA表達及心肌細胞凋亡的作用。方法心胸外科擇期行體外循環下心臟瓣膜置換手術的風濕性心臟瓣膜病患者60例按照隨機數字表法分為遠隔缺血時處理組和對照組，每組30例。兩組均給予心臟瓣膜置換手術，其中遠隔缺血時處理組在阻斷主動脈后立即實施下肢缺血/再灌注處理。 對照組放置止血帶但不進行充氣。分別在體外循環開始前及主動脈阻斷鉗開放后5 min內剪取右心耳組織作為檢測標本。實時定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測和驗證miR-1，miR-21，miR-24和miR-195的表達情況，并采用TUNEL法檢測心肌組織心肌細胞凋亡情況。結果遠隔缺血時處理組中miR-1和miR-195的表達較對照組降低明顯(P<0.05)，miR-24和miR-21的表達與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。在翻譯水平，遠隔缺血時處理組的Bcl-2的mRNA表達比對照組顯著上調(P<0.05)，而BAX，PDCD4的mRNA的表達則無明顯改變。心肌缺血前遠隔缺血時處理組和對照組心肌凋亡細胞數目較少，差異無統計學意義〔(4.3±0.3)% vs (4.1±0.2)%，P>0.05〕。心肌再灌注后兩組心肌凋亡細胞均較缺血前顯著增加，且遠隔缺血時處理組心肌凋亡較對照組減輕明顯(P<0.05)。結論遠隔缺血時處理可以調控體外循環心臟瓣膜置換術患者心肌MicroRNAs的表達，使miRNA-1和miRNAs-195表達下調，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達和減少促凋亡蛋白BAX表達，心肌細胞凋亡減少。

〔關鍵詞〕遠隔缺血時處理；微小RNA；心肌細胞凋亡；心臟瓣膜置換術

心臟外科小樣本量臨床研究證實，遠隔缺血時處理在 心臟和腎臟等器官保護中發揮作用，其能夠減少心臟瓣膜置換手術中心肌肌鈣蛋白(CTn)I釋放，以此來保護心肌〔1〕。但有報道指出，其對心肌等器官的保護效果不明顯〔2，3〕。因此，關于遠隔缺血時處理在心臟手術中的作用目前沒有完全統一的說法，且關于遠隔缺血時處理的較大樣本量的臨床研究尚缺乏。微小RNA(miRNAs )在缺血處理的組織及器官中的保護作用機制越來越受到重視〔4，5〕。 miRNAs是一類在進化上高度保守的小分子非編碼RNA，長度為19～25個核苷酸，可發揮轉錄后調控蛋白質編碼基因表達的作用。研究證實，當發生心肌缺血性損傷時，miRNAs被不同程度地表達，參與心肌缺血再灌注過程并發揮重要的調控相應基因的作用〔6，7〕。本文進一步明確遠隔缺血時處理對心肌miRNAs表達及心肌細胞凋亡的影響。

1資料與方法

1.1一般資料2013年1月至2015年1月在我院心胸外科擇期行體外循環下心臟瓣膜置換手術的風濕性心臟瓣膜病患者60例按照隨機數字表法分為遠隔缺血時處理組和對照組，每組30例。其中遠隔缺血時處理組男12例，女18例，年齡42～65歲，平均(52.1±10.5)歲；對照組男14例，女16例，年齡40～63歲，平均(53.9±8.4)歲。兩組年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。均經冠脈造影排除冠心病，且術前常規行胸片，心電圖和超聲心動圖檢查，肝腎功能電解質等測定。均知情同意，簽署同意書，并經倫理委員會通過。納入標準：①術前診斷均符合風濕性心臟瓣膜病的診斷標準；②行人工機械瓣膜置換或生物瓣膜者。 排除標準：合并冠心病或高血壓、合并感染性心內膜炎者；先天性心臟瓣膜疾病；合并周圍血管病；不愿意配合者。

1.2方法所有患者術前準備，全身麻醉后氣管插管，右頸內靜脈及橈動脈分別置管，連續監測體溫、心率、動脈血壓、中心靜脈壓等。全部手術均由同一外科醫生操作完成。術中肝素5 mg/kg，心臟停搏期間維持中度低溫(肛溫在28～31 ℃)，灌注流量約為25 L·min-1·體表面積-1。根據血氣調整pH為7.35，動脈血CO2濃度(PaCO2)為35 mmHg左右，動脈血氧濃度(PaO2)維持不低于200 mmHg。阻斷升主動脈后，以220～250 ml/min的流速從主動脈根部灌注，對于有明顯主動脈瓣關閉不全的患者，可直接切開升主動脈，給予冠狀動脈開口直接灌注。后進行正中胸骨切口，升主動脈遠端插動脈灌注管，建立常規的體外循環。視具體情況給予連續或間斷縫合。心內操作完畢后，開放主動脈阻斷鉗，主動脈根部吸引排氣。檢測血流動力學相關指標，一旦正常穩定，即可停機。常規關胸。其中遠隔缺血時處理組在阻斷主動脈后立即實施下肢缺血/再灌注處理。術中利用10 cm寬的止血帶包縛于患者右側下肢近心端，袖帶充氣并加壓至600 mmHg左右維持5 min，之后完全放氣維持5 min，重復3次。對照組放置止血帶但不進行充氣。術后均給予常規監護 。

1.3標本的采集分別在體外循環開始前及主動脈阻斷鉗開放后5 min內剪取右心耳組織作為檢測標本。 標本采集后立刻用冰生理鹽水進行快速漂洗，紗布去血后，直接存入液氮中保存備用。

1.4指標檢測①實時定量聚合酶鏈反應(PCR)(RT-PCR)檢測和驗證miR-1，miR-21，miR-24和miR-195的表達情況：其中雙向引物序列：Bcl-2為正義：3′GACCTGTAGAGCCGCTTCA5′，反義：3′CCACTTGACCCCCTCCTAA5′；BAX：正義：3′TGAGCCTTTTTCTGGAGAGCC5′，反義：3′GTTTGACCACGAGTTCCGAC5′；PDCD4 ：正義：3′AAGAGTTTACGGGAAAGTAGG′，反義：3′TCATAGGAATCGTAACCTCCCC′；Caspase3為正義：3′CAGAGTTACGGTGTCAGGTCAAG5′，反義：3′CCAAGTAGGTGAGCCGAAACAC5′；GAPDH：正義：3′TAGTGCGGTGTCAAAGGG5′，反義：3′AGTTGTCGCTGTGGGTGAG5′。②TUNEL法檢測心肌組織心肌細胞凋亡情況：采用TUNEL法對冰凍心肌組織標本進行凋亡細胞檢測，主要實驗試劑配制及實驗操作按照試劑盒進行，主要步驟為組織切片處理→DNA缺口末端標記→組織化學測定→對比染色→封片和顯微鏡檢。鏡檢TUNEL染色陽性細胞中有棕黃色顆粒者，即凋亡細胞 。顯微鏡下每張切片隨機選擇5個400倍視野，計算心肌細胞總數和陽性心肌細胞數，計算凋亡指數，其中凋亡指數=發生凋亡的細胞核數/細胞核總數×100%。

1.5統計學方法采用SPSS20.0統計軟件進行t檢驗，秩和檢驗。

2結果

2.1心肌miRNA表達實時熒光定量PCR驗證遠隔缺血時處理組中miR-1和miR-195的表達較對照組降低明顯(P<0.05)，miR-24和miR-21的表達情況與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2凋亡相關基因的檢測結果比較在翻譯水平，遠隔缺血時處理組Bcl-2 mRNA表達比對照組顯著上調(P<0.05 )，而BAX，PDCD4的mRNA的表達則無明顯改變。見表2。

表1　各組miRNA實時定量PCR測定結果比較

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

表2　兩組心肌Bcl-2 mRNA、BAX mRNA、

2.3心肌組織凋亡情況的TUNEL檢測結果比較心肌缺血前遠隔缺血時處理組和對照組心肌凋亡細胞數目較少，且兩組差異無統計學意義〔(4.3±0.3)% vs (4.1±0.2)%，P>0.05〕。心肌再灌注后兩組心肌凋亡細胞均較缺血前顯著增加，且遠隔缺血時處理組心肌凋亡較對照組減輕明顯〔(8.1±2.0)% vs (16.9±2.6)%，P<0.05〕。

3討論

術后多器官的損傷一直是影響心臟外科患者術后效果及遠期生存預后的重要因素。如何減輕體外循環心內直視手術對器官的損傷一直是該領域較為熱門的研究話題。心臟瓣膜疾病是后天性心臟病發病中較為常見的一種，其中風濕性心臟病作為導致心臟瓣膜病變的主要病因，能引起患者心肺肝腎等器官功能不同程度受損〔8～11〕。遠隔肢體缺血時處理能夠減緩心臟瓣膜置換手術心肌cTnI的釋放〔12〕。 miRNA的主要作用是與mRNA 3′端非翻譯區完全或不完全性互補結合，利用對靶mRNA的抑制或降解，降低相應蛋白表達水平〔13～15〕。 miRNA參與細胞凋亡、分化、能量代謝等多種細胞生理與病理過程，并與人類常見疾病如心肌梗死、心肌重構、心力衰竭、心律失常、心肌肥厚等都有一定的聯系〔16，17〕。部分miRNA還能夠參與心肌缺血再灌注損傷的發生和保護過程。miRNAs還可能參與體外循環心臟手術術后機體的全身炎癥反應等過程，通過調控某些蛋白質翻譯和表達，來影響機體多個重要信號傳導通路〔18～20〕。細胞凋亡途徑包括外源性途徑和內源性途徑。Bcl-1，Bax，caspase9、Caspase3等為miRNA調節內源性途徑介導的細胞凋亡的主要相關蛋白〔21，22〕。通過測定miR-133a、miR-133b、miR-208a的表達能夠了解術后早期的心肌損害及恢復情況〔23〕。本研究提示遠隔缺血時處理干預可以下調缺血再灌注心肌組織的miR-1和miR-195的表達。miR-1是高度表達于橫紋肌及成人心臟中的一種蛋白，miR-1在缺血再灌注損傷時表達有所增加，相對于健康成人，急性心肌梗死者的血漿miR-1水平升高顯著〔24〕；miR-195不僅可以調控細胞周期，并能夠加速細胞凋亡的進程〔25〕，有研究顯示，miR-195通過降低心肌細胞sirt1基因的表達來加速細胞的凋亡〔26〕。可見miR-1及miR-195在心肌損傷級細胞凋亡中扮演重要作用。本研究提示遠隔缺血時處理可能通過miR-1和miR-195的下調途徑使心肌細胞凋亡減輕。但確切的機制需要更加深入的研究。

Bcl-2基因是目前研究的最深入、最廣泛的凋亡調控基因之一。其表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵，參與細胞凋亡的信號轉導途徑 。 Bcl-2利用自身的BH3結構域與Bcl-2家族的促凋亡蛋白結合，進而來維持促凋亡成員在細胞內的定位分布，屏蔽細胞不進入凋亡程序，以此來發揮抗凋亡功效〔27〕。 Bax作為Bcl-2基因家族的一個亞型，是極重要的促細胞凋亡基因的一種，與Bcl-2發揮著相反的作用，能夠加速細胞的凋亡；下調miR-1可以減輕H2O2誘導的心肌細胞凋亡，其機制可能是利用調控抗凋亡基因Bcl-2轉錄后的表達來發揮其自身的作用。PDCD4是最早在動物體內發現的一種與細胞凋亡相關的基因，能夠利用自身功能區與真核細胞的翻譯起始因子eIF4A結合，阻止核糖體復合物及蛋白質的合成，加速細胞凋亡〔28〕。有學者指出，miR-21是通過作用于其靶基因PDCD4來發揮抗凋亡作用，進而發揮對抗缺血再灌注損傷的作用〔29〕。

綜上，遠隔缺血時處理可以調控體外循環心臟瓣膜置換術患者心肌MicroRNAs的表達，使miRNA-1和miRNAs-195表達下調，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達和減少促凋亡蛋白BAX表達，心肌細胞凋亡減少。 推測遠隔缺血時處理的心肌保護作用可能通過調控心肌miRNAs及其相應的靶基因和蛋白質表達而發揮作用。

4參考文獻

1Payne RE，Aldwinckle J，Storrow J，etal.RIPC remains a promising technique for protection of the myocardium during open cardiac surgery：a meta-analysis and systematic review 〔J〕.Heart Surg Forum，2015；18(2)：E74-80.

2Hepponstall M，Ignjatovic V，Binos S，etal.Remote ischemic preconditioning (RIPC) modifies the plasma proteome in children undergoing repair of tetralogy of fallot：a randomized controlled trial 〔J〕.PLoS One，2015；10(3)：e0122778.

3Mavrici D，Marakalala MJ，Holton JM，etal.Mycobacterium tuberculosis FtsX extracellular domain activates the peptidoglycan hydrolase，RipC 〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2014；111(22)：8037-42.

4Ivey KN，Srivastava D.microRNAs as developmental regulators〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2015；7(7)：a008144.

5El-Abd NE，Fawzy NA，El-Sheikh SM，etal.Circulating miRNA-122，miRNA-199a and miRNA-16 as biomarkers for early detection of hepatocellular carcinoma in egyptian patients with chronic hepatitis C virus infection 〔J〕.Mol Diagn Ther，2015；19(4)：213-20.

6Zhi C，Huang Y，Qi W，etal.Expression of microRNAs differed in the omental adipose tissue of obese rats 〔J〕.Int J Clin Exp Med，2015；8(4)：6601-6.

7Baglio SR，Rooijers K，Koppers-Lalic D，etal.Human bone marrow-and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species 〔J〕.Stem Cell Res Ther，2015；6(1)：127.

8Expert Group on Biomarkers.Biomarkers in cardiology-part 2：in coronary heart disease，valve disease and special situations 〔J〕.Arq Bras Cardiol，2015；104(5)：337-46.

9Coylewright M，Cabalka AK，Malouf JA，etal.Percutaneous mitral valve replacement using a transvenous，transseptal approach：transvenous mitral valve replacement 〔J〕.JACC Cardiovasc Interv，2015；8(6)：850-7.

10Cambray-Gutiérrez JC，Fernández-Muoz MJ，Del Rivero-Hernández LG，etal.Structural and functional heart diseases in adult patients with common variable immunodeficiency 〔J〕.Rev Alerg Mex，2015；62(2)：91-7.

11Hagège AA，Carpentier A，Levine RA.Dynamic changes of the mitral valve annulus：new look at mitral valve diseases 〔J〕.Circ Cardiovasc Imaging，2015；8(5)：e003539.

12Duan X，Ji B，Wang X，etal.Expression of microRNA-1 and microRNA-21 in different protocols of ischemic conditioning in an isolated rat heart model 〔J〕.Cardiology，2012；122(1)：36-43.

13Ye RS，Li M，Qi QE，etal.Comparative anterior pituitary miRNA and mRNA expression profiles of bama minipigs and landrace pigs reveal potential molecular network involved in animal postnatal growth 〔J〕.PLoS One，2015；10(7)：e0131987.

14Tian C，Ouyang X，Lv Q，etal.Cross-talks between microRNAs and mRNAs in pancreatic tissues of streptozotocin-induced type 1 diabetic mice 〔J〕.Biomed Rep，2015；3(3)：333-42.

15Xia Z，Liu F，Zhang J，etal.Decreased expression of MiRNA-204-5p contributes to glioma progression and promotes glioma cell growth，migration and invasion 〔J〕.PLoS One，2015；10(7)：e0132399.

16Wang C，Hu DZ，Liu JZ.Identification of critical TF-miRNA-mRNA regulation loops for colorectal cancer metastasis 〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(2)：5485-95.

17Hagrass HA，Sharaf S，Pasha HF，etal.Circulating microRNAs-a new horizon in molecular diagnosis of breast cancer 〔J〕.Genes Cancer，2015；6(5-6)：281-7.

18Yun SJ，Jeong P，Kang HW，etal.Urinary MiRNAs of prostate cancer：virus-encoded hsv1-miRH18 and hsv2-miR-H9-5p could be valuable diagnostic markers 〔J〕.Int Neurourol J，2015；19(2)：74-84.

19Qi P，Wang L，Zhou B，etal.Associations of miRNA polymorphisms and expression levels with breast cancer risk in the Chinese population 〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(2)：6289-96.

20Zhu LH，Miao XT，Wang NY.Integrated miRNA-mRNA analysis of Epstein-Barr virus-positive nasopharyngeal carcinoma 〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(2)：6028-36.

21Albrecht M，Zitta K，Bein B，etal.Remote ischemic preconditioning regulates HIF-1α levels，apoptosis and inflammation in heart tissue of cardiosurgical patients：a pilot experimental study 〔J〕.Basic Res Cardiol，2013；108(1)：314.

22Kocman EA，Ozatik O，Sahin A，etal.Effects of ischemic preconditioning protocols on skeletal muscle ischemia-reperfusion injury 〔J〕.J Surg Res，2015；193(2)：942-52.

23Han X，Yang F，Cao H，etal.Malat1 regulates serum response factor through miR-133 as a competing endogenous RNA in myogenesis 〔J〕.FASEB J，2015；29(7)：3054-64.

24Wu X，Li S，Xu X，etal.The potential value of miR-1 and miR-374b as biomarkers for colorectal cancer 〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(3)：2840-51.

25Xiao H，Zeng J，Li H，etal.MiR-1 downregulation correlates with poor survival in clear cell renal cell carcinoma where it interferes with cell cycle regulation and metastasis 〔J〕.Oncotarget，2015；6(15)：13201-15.

26Cai H，Zhao H，Tang J，etal.Serum miR-195 is a diagnostic and prognostic marker for osteosarcoma 〔J〕.J Surg Res，2015；194(2)：505-10.

27Pang RY，Guan MP，Zheng ZJ，etal.Effects of metformin on apoptosis induced by advanced glycation end-products and expressions of caspase-3，Bax and Bcl-2 in human dermal fibroblasts in vitro 〔J〕.J Southern Med Univ，2015；35(6)：898-902.

28Chen Z，Yuan YC，Wang Y，etal.Down-regulation of programmed cell death 4 (PDCD4) is associated with aromatase inhibitor resistance and a poor prognosis in estrogen receptor-positive breast cancer 〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2015；152(1)：29-39.

29Tong Z，Jiang B，Wu Y，etal.MiR-21 protected cardiomyocytes against doxorubicin-induced apoptosis by targeting BTG2 〔J〕.Int J Mol Sci，2015；16(7)：14511-25.

〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：海南省應用技術研發與示范推廣專項項目(No.ZDXM2015074)

〔中圖分類號〕R654.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2105-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.024

第一作者：邢杰(1965-)，男，副主任醫師，主要從事心臟病研究。