Klotho基因G-395A多態性與華中地區老年漢族人群頸動脈內中膜厚度的相關性

劉　瑋　張韶英　徐慧敏　管斯斯

(武漢市中心醫院老年科，湖北　武漢　430014)

?

Klotho基因G-395A多態性與華中地區老年漢族人群頸動脈內中膜厚度的相關性

劉瑋張韶英徐慧敏管斯斯

(武漢市中心醫院老年科，湖北武漢430014)

〔摘要〕目的探討Klotho基因G-395A位點多態性與華中地區老年(年齡≥60歲)漢族人群頸動脈內中膜厚度(IMT)的相關性。方法隨機選取278例華中地區老年漢族患者，根據IMT分為IMT增厚組(IMT≥1 mm，132例)和對照組(IMT<1 mm，146例)，分別檢測各組血壓、血糖、血脂等生化指標，并用TaqMan基因探針法檢測各組Klotho基因G-395A位點的基因型。結果與對照組相比，IMT增厚組GG基因型和G等位基因頻率明顯增高，AA基因型和A等位基因頻率明顯降低，AG基因型無明顯差異。經多元Logistic回歸分析后，G等位基因頻率與IMT增厚存在相關性，為IMT增厚的獨立危險因子。結論Klotho基因G-395A位點多態性與華中地區老年漢族人群頸動脈IMT具有相關性，G-395A多態性有可能作為頸動脈IMT增厚的預測指標之一。

〔關鍵詞〕Klotho基因；單核苷酸多態性；頸動脈內中膜厚度；動脈粥樣硬化

Klotho基因是Kuro-o等〔1〕于1997年發現的與衰老有關的新基因。Klotho基因被敲除的小鼠可出現類似人類衰老的各種表型，如壽命縮短、不育癥、動脈硬化、皮膚萎縮、骨質疏松、肺氣腫等〔2〕。目前的研究表明，Klotho基因與動脈粥樣硬化相關。Klotho基因缺陷的小鼠在出生4 w后即可出現動脈粥樣硬化，并隨著增齡而加重，表現為主動脈嚴重鈣化、肌性動脈中層鈣化、內膜增厚，這些變化與人類動脈粥樣硬化非常相似〔1〕。把外源性正常Klotho cDNA轉導給Klotho基因缺陷的小鼠后，其動脈粥樣硬化程度可得到顯著改善〔2〕。頸動脈內中膜厚度(IMT)增厚是動脈粥樣硬化病理過程中的早期標志，是反映大動脈粥樣硬化的早期的、無創性指標〔3，4〕。目前國內外有關Klotho基因多態性與頸動脈IMT增厚相關性的研究極少。本研究擬通過對Klotho基因G-395A多態性位點進行基因型分析，探討Klotho基因的G-395A位點多態性與老年人群頸動脈IMT增厚的關系。

1對象與方法

1.1研究對象樣本來自2012年3～11月武漢市中心醫院老年科，隨機選取年齡≥60歲的老年住院病人278例，男136例，女142例，年齡60～97歲。研究納入標準：年齡≥60歲，無親屬相關關系的、愿意接受項目研究者即可。所有參加研究對象均告知并簽署知情同意書。記錄入選病例的年齡，吸煙史，測量身高、體重、計算體重指數(BMI)，測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)，清晨空腹采血化驗血糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2頸動脈超聲檢查患者取臥位，頸部側伸45°，測定頸動脈IMT(以頸動脈球形膨脹近端1 cm范圍內作為頸總動脈測量區域，以頸總動脈后壁作為測量部位)，測定最厚處及距此遠心1 cm 和近心1 cm 點，左右兩側共6點的平均值作為結果。按照頸動脈IMT進行分組。IMT<1.0 mm 者入對照組(146例)；IMT≥1.0 mm者入IMT 增厚組(132例，包括發現頸動脈斑塊者89例)。其中每組又根據年齡分為老年組(年齡<80歲)和高齡組(年齡≥80歲)兩個亞組。

1.3方法

1.3.1DNA提取留取全部對象早晨空腹全血標本，抽取肘正中靜脈血5 ml，EDTA抗凝，用中國大連寶生物工程技術有限公司(TaKaRa)DNA抽提試劑盒提取DNA。

1.3.2Klotho基因G-395A SNP 檢測通過美國國家生物信息中心的GenBank獲取基因序列及其相應位點的SNP 信息。其中G-395A對應的SNP為rs1207568。由美國ABI公司合成TaqMan 引物和探針，用2×TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI，貨號：4351379，批號：P130715-008E09)試劑盒進行試驗，熒光定量PCR儀(ABI Stepone plus型)上進行擴增。上游引物：5′-TAGGGCCCGGCAGGAT-3＇；下游引物：5′-CCTGGAGCGGCTTCGTC-3＇。探針1：(VIC)-AGTCGGGAAAAGT-(MGB)；探針2：(FAM)-CAAGTCGGGGAAAG-(MGB) 。反應體系為：采用20 μl 反應體系，其中2×TaqMan Master Mix 10 μl，40×引物和TaqMan探針混合物0.5 μl，模板 DNA 2.0 μl，ddH2O 7.5 μl。PCR 反應條件如下：95℃預變性10 min，隨即進入PCR 循環，95℃變性15 s，60℃退火和延伸各1 min，共40個循環。

1.4統計學方法采用SPSS18.0軟件行t檢驗，研究對象基因型與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，應用多元Logistic回歸分析基因型與IMT增厚的相關性。

2結果

2.1IMT增厚組與對照組臨床資料分析兩研究組年齡、DBP、TC、TG、BMI無顯著差異(P>0.05)；IMT增厚組血糖、SBP、LDL-C水平、男性及吸煙比例明顯高于對照組，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平明顯低于對照組(P均<0.05)(表1)。

表1　兩組臨床資料比較±s)

2.2Klotho G-395A SNP分析Klotho基因型分布經χ2檢驗符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。與對照組相比，IMT增厚組GG基因型及G等位基因頻率均明顯升高(P<0.05)，IMT增厚組AA基因型及A等位基因頻率均明顯降低(P<0.05)，兩組AG基因型頻率無統計學差異(P<0.05)(表2)。亞組分析，與對照組相比，老年組以及高齡組患者的AA基因型及A等位基因頻率均明顯降低(P<0.05)，G等位基因頻率明顯增加(P<0.05)，AG基因型頻率無統計學意義(P>0.05)。高齡組較對照組GG基因型明顯增加(P<0.05)，而老年組與對照組的GG基因型無統計學差異(P>0.05)(表3)。

2.3Klotho基因G-395A位點G等位基因頻率與老年患者IMT增厚的關系在調整年齡、性別、吸煙、血壓、血脂和血糖等因素并經多元Logistic回歸分析后，G等位基因頻率與IMT增厚存在相關性，G等位基因為IMT增厚的獨立危險因子，而A等位基因頻率與IMT增厚存在負相關性，A等位基因對頸動脈IMT增厚具有保護作用(表4)。

表2　Klotho基因 G-395A 多態性分布〔n(%)〕

表3　不同年齡亞組Klotho基因G-395A多態性分布〔n(%)〕

表4　多元Logistic回歸分析

3討論

研究表明人類Klotho基因多個單核苷酸多態性位點與動脈粥樣硬化性疾病相關，如Kl-VS等位基因、G-395A多態性、C-1818T多態性等〔5～8〕。新近研究發現Klotho基因啟動區G-395A位點基因突變有可能就是該基因表達的一種潛在的調節靶點〔9〕。國外學者Imamura等〔10〕研究日本人群Klotho基因G-395A位點多態性與冠心病的關系時，發現A等位基因攜帶者其冠心病患病率較高。而同期Rhee等〔6〕在研究韓國60歲以上人群時，發現A等位基因對冠心病具有保護作用。在國內研究中，王虎林等〔11〕研究報道了在重慶地區的漢族人群中，Klotho基因G-395A位點A等位基因攜帶頻率與動脈硬化呈負相關。這說明Klotho基因啟動區G-395A位點多態性與冠心病的關系可能存在著地域和年齡效應。

血管壁IMT增厚是動脈粥樣硬化的早期征象，頸動脈和近心段的冠狀動脈由于所處的解剖部位比較特殊，血流的剪切力比較小，易于形成易損斑塊，造成動脈內膜損傷，管腔狹窄。頸動脈由于其位置表淺，用超聲檢測IMT的厚度可作為反映全身動脈硬化的一個窗口。IMT與動脈粥樣硬化危險因素數量間存在相關性，IMT的進展程度與速度更能反映或預測冠心病〔12，13〕。本研究結果說明了G-395A位點多態性與頸動脈IMT增厚的關系可能存在著年齡效應，G等位基因頻率與頸動脈IMT增厚存在相關性，為IMT增厚的獨立危險因子，而A等位基因對頸動脈IMT增厚具有保護作用。這與Rhee等〔6〕和王虎林等〔11〕的研究結果相符。目前對Klotho基因G-395A位點與冠心病的相關性研究有不同的研究結果。分析其原因首先可能與被研究人群的年齡、地區和種族差異以及冠心病的類型不同有關。其次，可能與樣本量與其他基因的交互作用有關。

綜上所述，本研究結果顯示Klotho基因啟動子G-395A位點可能是中國華中地區漢族人群IMT增厚的易感性位點和預測指標。

4參考文獻

1Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging〔J〕.Nature，1997；390(6655)：45-51.

2Masuda H，Chikuda H，Suga T，etal.Regulation of multiple ageing-like phenotypes by inducible klotho gene expression in klotho mutant mice〔J〕.Mech Ageing Dev，2005；126(12)：1274-83.

3Bonithon KC，Jouven X，Taquet A，etal.Early carotid atherosclerosis in healthy middle-aged women：a follow up study〔J〕.Stroke，1993；24(12)：1837-43.

4Geroulakos G，Gorman D，Alodiki E，etal.The carotid intima-media thickness as a marker of the presence of severe symptomatic coronary heart disease〔J〕.Eur Heart J，1994；15(6)：781-5.

5Arking DE，Becker DM，Yanek LR，etal.Klotho allele status and the risk of early-onset occult coronary artery disease〔J〕.Am J Hum Genet，2003；72(5)：1154-61.

6Rhee EJ，Oh KW，Lee WY，etal.The differential effects of age on the association of Klotho gene polymorphisms with coronary artery disease〔J〕.Metabolism，2006；55(10)：1344-51.

7Shimokata H，Ando F，Fukukawa Y，etal.Klotho gene promoter polymorphism and cognitive impairment〔J〕.Geriat Gerontol Int，2006；6(2)：136-41.

8Kim Y，Kim JH，Nam YJ，etal.Klotho is a genetic risk factor for ischemic stroke caused by cardioembolism in Korean females〔J〕.Neurosci Lett，2006；407(3)：189-94.

9Wang HL，Xu Q，Wang Z，etal.A potential regulatory single nucleotide polymorphism in the promoter of the Klotho gene may be associated with essential hypertension in the Chinese Han population〔J〕.Clin Chim Acta，2010；411(5-6)：386-90.

10Imamura A，Okumura K，Ogawa Y，etal.Klotho gene polymorphism may be a genetic risk factor for atherosclerotic coronary artery disease but not for vasospastic angina in Japanese〔J〕.Clin Chim Acta，2006；371(1-2)：65-70.

11王虎林，司良毅，孫蘭英，等.Klotho基因G-395A多態性與動脈硬化的相關性研究〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2008；10(2)：96-8.

12Takashi W，Tsutomu F，Kentaro F.Ultrasonic correlates of common carotid atherosclerosis in patients with coronary artery disease〔J〕.Angiology，2002;53(2)：177-83.

13Simon A，Gariepy J，Chironi G，etal.Intima-media thickness：a new tool for diagnosis and treatment of cardiovascular risk〔J〕.J Hypertens，2002；20(2)：159-69.

〔2014-12-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：武漢市科技局資助課題(No.201260523187-4)；武漢市衛生局資助課題(No.YB14B05)；院內基金(No.YB14B05)

通訊作者：張韶英(1963-)，女，學士，主任醫師，主要從事衰老及動脈粥樣硬化機制研究。

〔中圖分類號〕R543.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2132-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.037

第一作者：劉瑋(1981-)，女，博士，主治醫師，主要從事衰老及動脈粥樣硬化機制研究。