表皮生長因子受體表達與突變亞型在非小細胞肺癌中的臨床意義

張　競, 王　彬, 王云喜, 王　波, 初向陽

(解放軍總醫院 胸外科, 北京, 100853)

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表皮生長因子受體表達與突變亞型在非小細胞肺癌中的臨床意義

張競, 王彬, 王云喜, 王波, 初向陽

(解放軍總醫院 胸外科, 北京, 100853)

摘要:目的探討非小細胞肺癌(NSCLC)患者表皮生長因子受體(EGFR)基因的mRNA表達水平及EGFR亞型突變情況。方法收集128例NSCLC患者的臨床資料，使用液相芯片技術對患者標本的EGFR E18-21基因突變情況和EGFR的mRNA表達水平進行檢測。結果本組患者EGFR基因突變率為47.7%, 其中E19基因突變率為21.1%, E21基因的突變率為26.6%，無E18及E20基因突變。EGFR E19基因突變與吸煙史呈顯著相關性(r=0.238, P<0.01)，EGFR E21基因發生突變與腫瘤病理類型(r=-0.213, P<0.05)和腫瘤分化程度(r=-0.190, P<0.05)都呈現相關性。EGFR基因表達水平與腫瘤病理類型相關(r=0.244, P<0.01)。結論 EGFR突變好發于19、21外顯子，其中無吸煙史患者易發生E19突變，腺癌及腫瘤分化程度高的患者易發生E21突變。腺癌患者中的EGFR基因表達水平更高。

關鍵詞:非小細胞肺癌; 靶向治療; 表皮生長因子受體

約80%的肺癌患者病理類型為非小細胞肺癌(NSCLC)[1]。傳統治療肺癌的方法包括手術及放化療，但總體療效并未顯著提高。以表皮生長因子受體(EGFR)的小分子TKI(如厄洛替尼和吉非替尼)或單克隆抗體(如西妥昔單抗)為代表的EGFR基因靶向治療成為NSCLC的一線或二線治療方案[2-4]。本文收集128例確診非小細胞肺癌患者的臨床資料，采用Luminex液相芯片技術對腫瘤細胞的EGFR E18-21基因突變情況和EGFR基因的mRNA表達進行定量檢測，現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集解放軍總醫院胸外科2014—2015年經病理確診的非小細胞肺癌患者臨床資料共計128例，所有患者均未接受化放療、靶向治療等抗癌治療，無合并其他原發腫瘤，有完整的臨床資料及本院病理科病理報告。組織學標本由手術中切取或經皮肺穿刺得到。記錄患者年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度、TNM分期等相關臨床資料信息。本組患者中男67例，女61例；年齡小于60歲的患者85例，60歲以上的患者43例；92例無吸煙史，36例有吸煙史。病理類型為腺癌110例，鱗癌13例，腺鱗癌3例，大細胞癌1例，神經內分泌癌1例。腫瘤細胞低分化患者18例，中分化患者76例，高分化患者34例。TNM分期根據2009年美國癌癥聯合委員會(AJCC)和國際抗癌聯盟(UICC)聯合制定的國際肺癌分期(第7版)標準進行，全組患者中共有Ⅰ期患者85例，Ⅱ期患者15例，Ⅲ期及Ⅳ期患者28例。

1.2實驗方法

1.2.1實驗試劑：DNA提取試劑盒購自Macherey-Nagel公司，分子克隆酶購自Invitrogen公司，鏈霉親和素-藻紅蛋白購自QIAGEN公司，羧基化熒光微球及液相基因芯片系統均采用Luminex公司產品。

1.2.2EGFR基因突變檢測：對組織樣品采用xTAG-液相芯片法進行基因突變檢測，具體實驗步驟如下：首先使用Macherey-Nagel公司的DNA提取試劑盒，對腫瘤標本石蠟包埋組織切片中的基因組DNA進行提取，用分光光度計對DNA濃度進行定量，要求樣本濃度大于20 ng/μL，總量大于200 ng；然后進行聚合酶鏈式反應(PCR)預擴增，得到目標基因片段；使用核酸外切酶及堿性磷酸酶水解，消除多余的引物和核苷酸，防止其后續的探針非特異結合；進行等位基因特異引物延伸(ASPE)反應，ASPE引物上的特定性序列能特異地識別各等位基因型，從而保證延伸引物與作為模板的酶切產物準確結合，形成延伸產物。此反應步驟如下：首先在96℃的條件下進行預變性2 min，打開DNA雙鏈，然后在94 ℃的條件下變性30 s, 在52 ℃的條件下退火1 min, 最后在74 ℃進行延伸2 min, 后3步反復進行共計40次。隨后將微球和雜交液混合液45 μL渦旋30 s, 使微球充分混合后放入96孔板中，再加入ASPE產物5 μL, 進行雜交反應，在雜交孔中加入SA-PE 25 μL進行孵育，使引物上的Tag序列標簽同聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列互補配對。最后是讀取數據，將雜交后的微球放置于Luminex閱讀儀上進行數據讀取和分析，根據樣品的中位熒光值(MFI)判斷檢測基因是否發生突變。

1.2.3EGFR基因表達檢測：對組織樣品采用分支-DNA液相芯片法檢測基因表達水平，具體實驗步驟如下：① 用裂解液與樣本在56 ℃的環境中下持續反應2 h，使用超微量核酸蛋白分析儀測定信使核糖核酸純度。② 將支持延伸探針、支持探針-微球、樣本裂解液及緩沖液加入到孵育板，在55 ℃的條件下持續震蕩。③ 次日再把孵育板置于磁力架1 min, 使樣本液中磁性微球聚集于下方，將上清吸取去除。④ 將洗滌液加入樣本中進行震蕩，持續1 min，并再次將孵育板置于磁力架1 min后棄除上清，此步驟重復3遍。⑤ 將標記探針及擴增延伸探針放入孵育板中，于56 ℃的條件下持續反應1 h。將步驟3重復2遍。⑥ 加入SA-PE震蕩，在50℃的條件下持續30 min。重復步驟6。再次使用洗滌液，持續反應5 min后，放置在Luminex 閱讀儀上進行數據讀取和分析，取得mRNA檢測表達結果。判讀mRNA表達水平的方法為：用高、中、低3個等級來表示檢驗結果，表達水平<25%判讀為低表達，表達水平在25%～75%判讀為中表達，表達水平>75%判讀為高表達。評判標準是根據廣州益善生物檢驗所建立的中國肺癌人群數據庫所確定的。

1.3統計學分析

所有數據使用SPSS 19.0軟件錄入數據建立數據庫，并對所得數據進行統計學分析。EGFR基因突變及表達水平情況采用描述性統計分析方法，用χ2檢驗和Kruskal-Wallis秩檢驗進行EGFR基因亞型突變與各臨床因素之間的比較，用Spearman相關分析法計算EGFR基因表達水平與各臨床因素相關系數R，分析其相關程度。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1NSCLC患者的臨床資料及EGFR基因突變、表達水平情況

本研究共有128例NSCLC患者。突變檢測結果提示，61例患者發生基因突變，總體突變率為47.7%，其中27例發生19外顯子突變，34例發生21外顯子突變，無18外顯子突變及20外顯子突變病例。所有基因突變均為單發，未發生2個及以上基因同時突變的情況。EGFR E19野生型占78.9%(101/128)，EGFR E21野生型占73.4%(94/128)。對入組患者的EGFR基因表達水平進行測定，按照判讀方法將基因表達值分為高、中、低3個級別，其中高表達36例(28.1%)，中表達65例(50.8%)，低表達27例(21.1%)。EGFR基因表達水平中位數為0.562，均值為0.675，標準差為0.560，最小值為0.039，最大值為3.994，正態檢驗統計量為0.815，P<0.0001。

2.2EGFR E19、E21基因突變與NSCLC患者臨床參數的差異性分析

在128例NSCLC患者中，無吸煙史患者EGFR E19基因突變率為37.3%，而有吸煙史的患者突變率為5.8%，差異有統計學意義(P<0.05)；在患者年齡、性別、病理類型、分化程度、TNM分期等比較中，EGFR E19基因突變差異無統計學意義(P>0.05)。腺癌患者中的EGFR E21基因突變率為44.7%，非腺癌患者的E21基因突變率為0.0%；腫瘤高分化患者的EGFR E21突變率為100%，中、低分化的患者的突變率分別為22.6%、5.9%，差異均有統計學意義(P<0.01)。說明腫瘤分化高的腺癌患者更可能產生EGFR E21基因突變。見表1。

表1　EGFR E19基因突變情況與臨床參數的差異性分析

與野生型比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.3EGFR基因突變與NSCLC患者臨床參數的相關性分析

對于EGFR基因突變與臨床參數的相關性，作者應用Spearman秩和相關分析進行統計。數據分析顯示，EGFR基因19外顯子突變與吸煙史有顯著相關性(r=0.238,P<0.01)，表明EGFR E19基因在無吸煙史患者中的突變率高于有吸煙史的患者。EGFR基因21外顯子發生突變與腫瘤病理類型和腫瘤分化程度都呈現相關性(r=-0.213、-0.190,P<0.05)，表明腺癌患者、腫瘤分化程度越高的患者較其他患者發生EGFR E21基因突變的概率更高。見表2。

表2　EGFR基因突變與NSCLC 患者臨床參數相關性分析

2.4EGFR基因表達水平與NSCLC患者臨床參數的關系

對EGFR基因表達水平與各臨床參數的相關性進行Spearman秩相關分析。數據分析顯示，EGFR基因的表達水平和病理類型呈現顯著相關性(r=0.244,P<0.01)，說明EGFR表達水平在非腺癌患者中偏低，而在腺癌患者中較高。見表3。

表3　EGFR、VEGFR-2基因表達水平與臨床參數的關系

3討論

EGFR是一種受體酪氨酸蛋白激酶，共包含28個外顯子，位于第7號染色體p13-q22區，能夠編碼1 186個氨基酸，相對分子質量為170 KDa, 被歸為表皮生長因子家族。EGFR廣泛分布在各種上皮細胞的細胞膜上，胞外為配體結合區，能夠與可溶性或膜結合的多肽或蛋白類激素結合；細胞膜之間為跨膜疏水區；胞內為酪氨酸激酶區，能夠與聯結蛋白(adaptor)GrB2和SOS相結合。EGFR過度表達和自我激活可能會導致癌癥細胞增殖、凋亡、浸潤和轉移，刺激和誘導腫瘤新生血管的形成[4]。EGFR的過度表達在NSCLC、乳腺癌、胃腸道腫瘤、前列腺癌、頭頸鱗癌等多種惡性腫瘤組織中均能得到證實。目前很多學者建議將EGFR基因在腫瘤組織中的表達及變異聯合起來進行檢測判斷，以指導NSCLC患者的靶向治療及預后判斷。

有研究[5]統計中國非小細胞肺癌中EGFR基因突變的發生率為34.0%。Paez等[6]報道指出18～21外顯子是發生EGFR基因突變的主要位點，其中19外顯子的缺失突變和21外顯子的點突變占到EGFR突變的絕大部分。Kosaka等[7]也得出EGFR基因突變總數90%以上為19、21外顯子突變。本組128例NSCLC患者，共有61例患者發生EGFR基因突變(47.7%)，其中19外顯子突變27例，占突變總數的44.3%；21外顯子突變34例，占突變總數的55.7%。

Lynch等[2]對EGFR基因突變的NSCLC患者的臨床特征關系進行了分析，表明發生EGFR突變在不同性別及病理類型的病例中存在差異，女性突變發生率高于男性；腺癌的突變率高于其他病理類型。此外，非吸煙者的突變率要高于吸煙者。19、21外顯子突變肺癌患者的臨床病理特征的差異仍存在爭議。國內學者[8]報道，19外顯子突變肺癌患者相對21外顯子突變肺癌患者而言，女性突變率較高。作者將EGFR 19和21外顯子分別與肺癌患者年齡、性別、吸煙情況、病理類型、分化情況及TNM分期等進行統計，結果顯示無吸煙史患者中有25例發生EGFR E19基因突變，突變率37.3%(25/67)；吸煙患者中有2例發生EGFR E19基因突變，突變率6%(2/34)，差異有統計學意義(P<0.05)。34例EGFR E21基因突變全部發生在腺癌患者，其中高分化患者突變率為100%，差異有統計學意義(P<0.05)。進一步相關分析發現，EGFR基因19外顯子突變與吸煙史呈現顯著相關性(r=0.238,P<0.01)，EGFR基因21外顯子發生突變與腫瘤病理類型和腫瘤分化程度都呈現相關性(r=-0.213、-0.191,P<0.05)，與其他的臨床病理特點無相關性，表明無吸煙史、腺癌患者、腫瘤分化程度越高，發生19或21外顯子突變的概率更高。劉仁旺等[9]對EGFR 19和21外顯子突變肺癌患者的臨床特征進行比較，發現二者在性別、吸煙狀況、組織類型、分期及分化程度上無顯著差異。本組結果與其有差異，分析原因可能為本研究著重于19、21外顯子突變患者與臨床病理特征的對比，EGFR基因未發生突變的患者被排除，直接對比2組基因突變患者各參數的比例的差異。本研究發現女性患者的基因總體突變率高于男性，但差異無統計學意義(P>0.05)，可能與研究對象為基因突變亞型有關。也有部分學者[10]認為，鱗癌患者多為有吸煙史的男性，在校正了吸煙狀態后進行統計分析顯示EGFR突變與性別無關。Toyooka等[11]對431例NSCLC樣本進行了EGFR突變和臨床因素的相關性研究。在單變量分析中，在無吸煙史患者、女性及病理類型為腺癌的患者中，EGFR突變檢出率要高于吸煙者、男性和非腺癌患者。進行多變量分析后發現EGFR突變只與無吸煙史、腺癌組織有關系。

研究[12-13]證實EGFR在肺癌中存在著高分布表達，表達率為40%～80%。Jeon YK等[14]報道EGFR在肺癌中的表達為53.1%～69.7%。研究[15]顯示，很多患者存在EGFR的過表達或異常激活，表達率越高，腫瘤惡性度也越高，越容易發生浸潤、轉移。Ahn JH等[16]對65例肺癌術后患者的免疫組化結果進行統計后提出，EGFR的表達與性別、年齡、TNM分期、病理類型等臨床因素均無關系。在本組實驗中，128例NSCLC患者EGFR表達水平呈正偏態分布，以中表達為主，行相關性統計提示其與病理類型有顯著相關性(P<0.01)，即更容易在腺癌中高表達。而在年齡、性別、分化程度等分組中，EGFR 表達水平無顯著差異(P>0.05)。Brabender等[17]對83例患者手術標本用PCR技術進行基因突變分析，結果顯示EGFR高表達患者的生存期較短。但Ahn JH認為EGFR在肺癌發生而非腫瘤進展方面起到影響作用，所以EGFR的表達與肺癌預后的關系不大[18-22]。

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Clinical significance of epidermal growth factor receptor expression and its subtype mutations in non-small cell lung cancer

ZHANG Jing，WANG Bin，WANG Yunxi，WANG Bo，CHU Xiangyang

(DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofPeople’sLiberationArmy,Beijing, 100853)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the mRNA expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and its subtype mutations in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). MethodsClinical materials of 128 NSCLC patients were collected. E18-21 mutations of EGFR and mRNA expression of EGFR in fresh specimens of tumor tissues were detected by liquid chip technology. ResultsThe mutation rate of EGFR gene was 47.7%, including 21.1% E19 gene mutation, 26.6% E21 gene mutation, 0% E18 and E20 gene mutations. There was a significant correlation between EGFR E19 gene mutation and smoking history (r=0.238, P<0.01). EGFR E21 gene mutation had correlations with tumor histological type (r=-0.213, P<0.05) and the degree of tumor differentiation (r=-0.190, P<0.05). EGFR gene expression was associated with tumor type (r=0.244, P<0.01). ConclusionEGFR mutations tend to occur in exons 19 and 21. E19 mutation easily occurs in patents without smoking history and E21 mutation easily occurs in patients with high-differentiated adenocarcinoma. EGFR gene expression is highly expressed in adenocarcinoma patients.

KEYWORDS:non-small cell lung cancer; targeted therapy; epidermal growth factor receptor

中圖分類號:R 734.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)09-092-05

DOI:10.7619/jcmp.201609027

通信作者:初向陽, E-mail: drchu301@aliyun.com

收稿日期:2016-02-16