腫瘤相關巨噬細胞促進非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲的研究

吳奇勇, 戚春建, 陳　晨, 王　勇

(南京醫(yī)科大學附屬常州市第二人民醫(yī)院, 胸心外科, 腫瘤實驗室, 江蘇 常州, 213003)

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腫瘤相關巨噬細胞促進非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲的研究

吳奇勇, 戚春建, 陳晨, 王勇

(南京醫(yī)科大學附屬常州市第二人民醫(yī)院, 胸心外科, 腫瘤實驗室, 江蘇 常州, 213003)

摘要:目的研究腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)對非小細胞肺癌增殖、轉移的影響。方法免疫組化方法分析肺癌組織中巨噬細胞浸潤情況。CCK-8法和Transwell法分別檢測單核巨噬細胞系THP-1(構建為M2型TAMs后)對肺癌細胞系A549細胞增殖和侵襲能力的影響。結果免疫組化結果顯示，TAMs浸潤數(shù)在肺癌組織中顯著多于癌旁組織。激活誘導的TAMs細胞促進A549細胞的增殖和侵襲。結論巨噬細胞浸潤增加造成的腫瘤周圍炎癥微環(huán)境可能是肺癌發(fā)展的機制之一。

關鍵詞:腫瘤相關巨噬細胞; 非小細胞肺癌; 增殖; 轉移

肺癌是發(fā)病率第一的惡性腫瘤，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，失去手術治療的機會，非小細胞肺癌是肺癌的主要類型之一。晚期的非小細胞肺癌患者化療的有效率不足30%，至疾病進展時間為4～6個月，2年生存期約10%，其中癌細胞的廣泛轉移是非小細胞肺癌死亡率高的重要原因之一[1]。最近的研究[2]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞與周圍的免疫細胞通過旁分泌促進腫瘤的侵襲。腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)是影響腫瘤微環(huán)境的重要免疫細胞，它定位于腫瘤上皮組織、間質、壞死區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣，被認為是腫瘤進展的一個重要的生物標志[3]。本研究擬通過構建共培養(yǎng)模型，探討TAMs對非小細胞肺癌侵襲的作用。

1材料與方法

1.1病例采集及病理診斷

選取2010年1月—2011年3月南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院心胸外科就診的非小細胞肺癌患者的石蠟組織，進行常規(guī)免疫組化ABC法染色。主要步驟為：切片、脫蠟、水化; Tris-EDTA抗原修復; 3%H2O2滅火內源性過氧化物酶; 10%羊血清封閉；一次孵育一抗CD68(Abcam公司，1∶3 000稀釋)、二抗；DAB顯色；蘇木素復染；常規(guī)脫水、透明、封片。巨噬細胞技術：每例隨機選取8個不重疊的視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，對結果進行單因素方差分析。

1.2材料

肺癌細胞株A549以及人單核細胞系THP-1均購置中國科學院上海細胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清(FCS)及胰酶購置Gibco公司；佛波酯(PMA)購置Sigma公司；Transwell板購置美國corning公司；Matrigel膠購置BD公司。

1.3細胞培養(yǎng)

肺癌細胞株A549和人單核細胞系THP-1均培養(yǎng)于含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。THP-1細胞經800 g離心3 min后換液或傳代，須維持細胞圓、亮、單個的懸浮狀態(tài)。懸浮的THP-1按照1×106/mL接種，PMA 60 nmol/L誘導24 h后細胞貼壁，加入IL-4 20 nmol/L, 繼續(xù)培養(yǎng)18 h, 即得到體外誘導的TAM細胞。

1.4THP-1與A549共培養(yǎng)處理

由于誘導活化為TAMs后的巨噬細胞為終末細胞，不再具有分裂增殖的能力，所以將其與A549細胞共培養(yǎng)后，CCK-8檢測的僅為A549的增殖效應。具體操作如下：將A549與TAMs分別按1∶1、1∶2、1∶3、1∶6的比例接種于96孔板的同一孔中(每孔為1 000個細胞)，對照組只接種1份THP-1或1、2、3、6份A549，每組設5個復孔，48 h后檢測CCK-8數(shù)值。將共培養(yǎng)組的吸光度值(OD)減去單份 THP-1的OD值后與相應的對照組作比較，對結果進 行單因素方差分析。

1.5侵襲實驗

基質膠(BD matrigel)4 ℃過夜凍融，使用當天所有耗材預冷，將基質膠按1∶5稀釋，向每個transwell小室內鋪膠30 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中至膠完全凝固。分別處理細胞THP-1、A549至密度為2×105/mL, 上室加入200 μL A549，下室加入600 μL TAMs，對照組的下室只加RPMI 1 640培養(yǎng)基。24 h后，棄去上室中培液, PBS洗3遍，固定15 min (固定液為甲醇∶冰醋酸=3∶1的混合液，用前配制)后, 0.1%結晶紫(美國Sigma公司)室溫染色2 h，清水洗3遍以上。將小室倒置，鏡下拍照，并隨機選取5個不重復的400高倍視野來計數(shù)，對結果進行t檢驗分析。

1.6統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)處理采用Graph Pad 5.0軟件包，進行單因素方差分析和t檢驗分析處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1肺癌組織和肺癌良性組織中TAM浸潤情況

本實驗所有病例的癌組織中均可見TAM浸潤，在間質和癌巢中均可見棕色(CD68+)陽性的TAM分布，30例非小細胞肺癌病理切片中TAM平均浸潤密度34.7/高倍鏡視眼(HP)，中位數(shù)為17/HP。見圖1。

A: 低表達組; B: 高表達組

圖1TAM在非小細胞肺癌中的表達

2.2人巨噬細胞的誘導活化和表型鑒定

懸浮的人THP-1單核細胞用PMA處理后，增殖停止并貼壁，CD68表達增高(圖2A)，被誘導為巨噬細胞。再加入IL-4，活化為TAM細胞。RT-PCR顯示誘導分化后細胞高表達IL-10，Arginase (圖2B)。

A: 流式細胞術檢測CD68的表達(實心圖為同型對照, 虛線為THP-1未用PMA激發(fā)的細胞,實線為THP-1細胞用PMAs激發(fā)后的細胞); B: IL-10, Arginase mRNA的相對表達量

圖2TAM誘導活化及鑒定

2.3活化誘導的TAMs細胞促進A549細胞增殖

TAMs細胞的培養(yǎng)上清可促進A549細胞增殖, 96 h增殖率為1.785(圖3A)，將TAMs細胞與A549以不同比例共培養(yǎng)48 h，亦可誘導A549細胞增殖，并且在A549: TAMs達到1∶3時可以誘導A549顯著增殖，增殖率為2.136(圖3B)。

A: TAMs細胞培養(yǎng)上清對A549細胞增殖的影響;

B: 不同比例的A549細胞和TAMs細胞共培養(yǎng)對A549細胞增殖的影響

圖3TAMs細胞對A549細胞增殖活性的影響

2.4TAMs細胞促進A549細胞侵襲

如圖4所示，TAMs可以促進A549的侵襲，鋪過基質膠之后，實驗組從transwell上室穿出的A549較對照組穿出的細胞顯著增加，穿出的細胞多分布于膜中央，膜邊緣的細胞成團分布。

圖4TAMs細胞對A549細胞侵襲的影響

3討論

腫瘤微環(huán)境是指由大量各種類型的細胞共同構成的一種腫瘤的局部病理環(huán)境。腫瘤相關巨噬細胞(TAM)是大量存在于腫瘤微環(huán)境中的白細胞群體[4]。巨噬細胞在體內不同的微環(huán)境影響下可分別表現(xiàn)為兩種活化類型：M1型巨噬細胞為經典活化的巨噬細胞，M2型巨噬細胞為替代性活化的巨噬細胞[4-6 ]。M1型巨噬細胞可在I型輔助性T細胞因子如γ-干擾素和細菌產物脂多糖的誘導下產生，表現(xiàn)為高表達白細胞介素(IL)-12、IL-23、內源性活性氧(ROS)和一氧化氮，低表達IL-10和IL-4，抗原提呈功能增強，促進T細胞增殖活化，主要起殺傷細菌、抗腫瘤、產生炎性因子、激活免疫應答的作用[2-3，7]。M2型巨噬細胞可由IL-4、IL-10、IL-13等誘導產生，表現(xiàn)為高表達IL-10或IL-4，低表達IL-12，低抗原提呈能力等特征，具有清除碎片，促進血管生成、組織重建及損傷修復作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起促進作用[4-6]。

TAMs的功能作用具有組織特異性和時相性，既在不同腫瘤組織、I-J種腫瘤的不同部位以及在同一腫瘤的不同發(fā)展階段都具有不同的功能[7]。TAMs在癌前階段只表達iNOS(稱為M1型TAMs)，腫瘤惡變過程中逐漸喪失表達iNOS，而表達arginase(稱為M2型TAMs)。不同類型的TAMs表達細胞因子(如M1型TAMs分泌INF，M2型TAMs則主要分泌TGF-beta)決定腫瘤演進與發(fā)展方向預后[8-9]。

TAMs是腫瘤炎癥微環(huán)境的重要組成，目前發(fā)現(xiàn)TAMs與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在直接聯(lián)系，包括乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、甲狀腺癌和淋巴瘤等，TAMs具有促進腫瘤的侵襲轉移和血管形成等作用。TAMs可以與腫瘤干細胞相互作用，促進腫瘤發(fā)生、轉移和耐藥[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)在CD68+浸潤細胞方面，病變組織的巨噬細胞大，形態(tài)不規(guī)則，核呈明顯的新月形或馬蹄形，胞質內有大量的吞噬顆粒，巨噬細胞周圍并行大量淋巴細胞，這些都說明病變或癌前病變組織中的巨噬細胞是已活化的，發(fā)揮功能作用的細胞。本研究成功地將THP-1細胞誘導出CD68+，IL-10，Arginase高表達的TAMs細胞。關于TAMs對肺癌細胞的作用，本研究發(fā)現(xiàn)，TAMs細胞可以促進A549細胞的增殖和侵襲，TAMs的促侵襲轉移作用被認為是M2型巨噬細胞有別于M1型的重要方面，也是免疫抑制實現(xiàn)的重要途徑[11]。有研究表明在肺癌的腫瘤微環(huán)境中，TAMs只有與腫瘤細胞相互作用才有明顯的促進腫瘤轉移的效應，可能是因為腫瘤細胞與TAMs能夠通過旁分泌細胞因子的途徑相互作用，通過細胞因子形成旁分泌環(huán)，促進腫瘤細胞侵襲轉移。

參考文獻

[1]Zarogoulidis K, Zarogoulidis P, Darwiche K, et al. Treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC) [J]. Journal of thoracic disease, 2013, 5(Suppl 4): S389-396.

[2]Champiat S, Ileana E, Giaccone G, et al. Incorporating immune-checkpoint inhibitors into systemic therapy of NSCLC [J]. Journal of thoracic oncology: official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer, 2014, 9(2): 144-153.

[3]Laoui D, Van Overmeire E, De Baetselier P, et al. Functional Relationship between Tumor-Associated Macrophages and Macrophage Colony-Stimulating Factor as Contributors to Cancer Progression [J]. Frontiers in immunology, 2014, 5: 489-498.

[4]Schmieder A, Michel J, SchOnhaar K, et al. Differentiation and gene expression profile of tumor. associated macrophages[J]. Semin Cancer Biol, 2012, 22(4): 289-297.

[5]Shirabe K, Mano Y, Muto J, et al. Role of tumor-associated macrophages in the progression of hepatocellular carcinoma[J]. Surg Today, 2012, 42(1): 1-7.

[6]Wang X F, Wang H S, Zhang F, et al. Nodal promotes the generation of M2-like macrophages and down regulates the expression of IL-12[J]. Eur J Immunol, 2014, 44(1): 173-183.

[7]Chen J J, Lin Y C, Yao P L, et al. Tumor-associated macrophages: the double-edged sword in cancer progression[J]. J Clin Oncol, 2005, 23(5): 953-964.

[8]Redente E F, Dicky D J, Bouchard R J, et al. Tumor signaling to the bone marrow changes the phenotype of monocytes and pulmonary macrophages during urethane-induced primary lung tumorigenesis in A/J mice[J]. Am J Pathol, 2007, 170(2): 693-708.

[9] Mills C D, Kincaid K, Ah JM, et a1. M-1/M-2 macrophages and the Thl/Th2 paradigm[J]. J Immunol, 2000, 164(12): 6166-6173.

[10] Galdiero M R, Bonavita E, Barajon I, et al. Tumor associated macrophages and neutrophils in cancer [J]. Immunobiology, 2013, 218(11): 1402-1410.

[11] Mantovani A, Germano G, Marchesi F, et al. Cancer promoting tumor-associated macrophages: new vistas and open questions[J]. European journal of immunology, 2011, 41(9): 2522-2525.

Effect of tumor-associated macrophages on promotion of proliferation and metastasis of non-small cell lung cancer

WU Qiyong, QI Chunjian, CHEN Chen, WANG Yong

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,TumorLaboratory,ChangzhouSecondPeople′sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213003)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of tumor-associated macrophages (TAMs) on promotion of the proliferation and metastasis of non-small cell lung cancer. MethodsThe infiltration of macrophages in the lung cancer tissues was analyzed by immunohistochemical method. The effects of monocyte/macrophage cell line THP-1 (after construction of M2-type TAMs) on the proliferation and invasion of human lung cancer cell line A549 were evaluated by CCK-8 and Transwell methods. ResultsImmunohistochemical results revealed that the quantity of infiltrated TAMs in the lung cancer tissues was significantly than that in the para-carcinoma tissues. The activated TAMs accelerated the proliferation and invasion of A549 cells. ConclusionThe micro environment surrounding the inflammatory microenvironment caused by the infiltration of macrophages may be one of the mechanisms of the development of lung cancer.

KEYWORDS:tumor-associated macrophages; non-small cell lung cancer; proliferation; metastasis

中圖分類號:R 734.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)09-101-04

DOI:10.7619/jcmp.201609029

基金項目:江蘇省自然科學基金(BK2012590)

收稿日期:2015-12-20