短期DC-CIK生物免疫療法治療中晚期食管癌患者的療效觀察

奚小祥, 陳　浩

(1. 江蘇省泰興市人民醫院 胸外科, 江蘇 泰興, 225400; 2. 南京德塔生物技術有限公司, 江蘇 南京, 210004)

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短期DC-CIK生物免疫療法治療中晚期食管癌患者的療效觀察

奚小祥1, 陳浩2

(1. 江蘇省泰興市人民醫院 胸外科, 江蘇 泰興, 225400; 2. 南京德塔生物技術有限公司, 江蘇 南京, 210004)

關鍵詞:DC-CIK; 食管癌; 淋巴細胞亞群

食管癌是一種最具侵襲性的腫瘤，其微小轉移灶難以發現并清除，患者整體預后及療效不佳[1-2]。細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)具有高增殖能力和高細胞毒性，對惡性腫瘤有療效。樹突狀細胞(DC)是目前已知的最強的抗原提呈細胞(APC)，它能夠顯著地刺激初始型T細胞增殖，在腫瘤免疫治療中起著重要的作用[3]。本研究探討DC-CIK治療中晚期食管癌患者的療效，現報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取2013年1月—2015年12月泰興市人民醫院腫瘤科采用DC-CIK治療的食管癌患者28例，年齡48～86歲，中位年齡67歲，KPS評分>70分。入選標準: ① 確診為惡性腫瘤患者; ② 卡氏評分大于60分; ③ 預計生存期大于6個月; ④ 重要生命器官正常。排除標準: ① 骨髓、心、肝、腎、肺等重要器官功能嚴重衰竭者; ② 臟器移植者; ③ 懷孕或正在哺乳的婦女; ④ 阻礙簽署知情同意者; ⑤ 嚴重自身免疫性疾病。28例患者中，男24例，女4例；年齡49～86歲；腫瘤分期為II期10例，III期11例，IV期7例；接受過手術+化療3例，手術11例，放療2例，化療6例，未接受治療6例；轉移部位有肝轉移3例，縱膈淋巴結轉移3例，肺轉移7例，淋巴結轉移4例，淋巴結及肝轉移1例，肝脾轉移1例，心臟淋巴結轉移2例，肺淋巴結轉移4例，喉淋巴結轉移1例，肺及腦膜轉移1例，無轉移1例。

1.2主要試劑和儀器

細胞培養箱、離心機、RPMI-1640培養基(WISENT 公司)、Ficoll(上海華精生物高科技有限公司)、rhIL-4(Peprotech公司)及GM-CSF (Peprotech公司)、rhIL-1(Peprotech公司)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(Peprotech公司)、CD3單抗(Peprotech 公司)、干擾素-γ(IFN-γ)(Peprotech 公司)、rhIL-1、rhIL-2(Peprotech公司)。

1.3DC-CIK細胞治療方法

1.3.1DC-CIK制備及回輸流程：DC-CIK細胞制備。28例患者在術后第2周人工采集患者外周血100～150 mL，常規 Ficoll分離外周血單個核細胞(PBMC)，經洗滌、離心收集純化的 PBMC，進行貼壁分離RPMI-1640培養基培養，分別誘導DC及CIK的活化。DC培養基30 mL，添加細胞因子rhIL-4及GM-CSF，第5天添加 rhIL-1及TNF-α誘導成熟，第7天收獲 DC 刺激 CIK。CIK 培養基 30 mL，調整細胞密度3 M/mL，抗人CD3單抗(包被液處理)，添加IFN-γ、rhIL-1、rhIL-2進行誘導活化，后期添加 rhIL-2 進行增殖擴瓶。將培養8～10 d的細胞離心、洗滌、收獲，取部分細胞進行細菌、霉菌的檢測，然后按每次6×108～8×108的量溶于100 mL生理鹽水中，2 h內回輸至患者體內，每天回輸1次，連續5次為1個療程。

1.3.2DC-CIK細胞質量控制：除嚴格控制細胞制備過程外，作者采用以下指標對細胞進行質量檢驗: ① 細胞數量控制; ② 細胞存活率控制; ③ 細胞表型檢測; ④ 內毒素檢測。

1.3.3術后、化療及DC-CIK的綜合治療方案：3例患者在術后第2周采取外周血100～120 mL

用于DC-CIK細胞的體外培養和擴增，1周后回輸患者體內，術后第4周行第1周期化療。其后序貫進行第2、3周期的化療。11例患者術后2周采集外周血100～120 mL用于DC-CIK 細胞治療。8例患者在DC-CIK細胞回輸1周后進行同期放化療。

1.4療效評價

臨床療效按RECIST標準分為CR、PR、SD、PD。以CR+PR計算客觀緩解率(ORR), CR+PR+SD計算疾病控制率(DCR)。患者接受免疫治療后的1個月進行原病灶及轉移灶CT掃描等檢查來評估疾病治療狀況。記錄患者出現的不良反應。分別于患者抽血前和DC-CIK回輸1周及1個月后抽取外周血2 mL(抗凝血)，流式細胞儀檢測患者外周血淋巴細胞免疫細胞CD3+、CD4+、CD16+CD56+、TH/TS。觀察患者治療前后血常規、肝、腎功能變化。

2結果

28例患者經DC-CIK聯合治療后，CR 0例，PR 12例，SD 9例，PD 7例，ORR為43%，DCR為75%。DC-CIK治療后，1例患者影像學檢查顯示原發灶和轉移灶明顯減少，未見高代謝腫瘤殘存癥狀。

DC細胞表面有樹突狀突起，隨著成熟誘導，其表面突起愈加明顯，將成熟DC與CIK按1∶10混合培養。倒置顯微鏡下清晰可見漂浮DC-CIK細胞，細胞體積增大，透明，折光性強，形態不規則，且培養后期細胞密度增大，形態呈橢圓形。細胞制劑臨床達109數量級，臺酚藍染色活細胞比例>90%，微生物培養陰性，內毒素檢查陰性，上清肝炎、梅毒、HIV抗體檢測均為陰性。

CD3+、CD4+比例在DC-CIK治療后有所上升；CD16+CD56+治療后及1個月后較治療前顯著升高(P<0.05)；治療后TH/TS較治療前顯著降低(P<0.05)，1個月后其數值較治療前、治療后顯著增加(P<0.05)。見表1。28例患者在治療過程中均未出現發熱、嘔吐等不良反應，治療前后血常規、肝、腎功能檢測指標均無明顯變化。

表1　28例患者治療前后淋巴T細胞亞群變化比較

與治療前比較, #P<0.05; 與治療后比較, *P<0.05。

3討論

據國際癌癥機構[4]統計，全世界每年有1 410萬例新發癌癥病例，802萬例死亡，而食管癌成為世界癌癥患者死亡的主要因素之一。食管癌主要的治療方法是手術或者聯合放化療治療方案，且預后生存率較差，5年生存率僅為23.1%[5]。細胞免疫治療日趨活躍，DC細胞即樹突狀淋巴細胞，是正常人體內存在的一種具有抗原提呈功能的特殊細胞，能夠直接攝取、加工和呈遞抗原，刺激體內初始型T細胞活化，調控機體免疫應答。CIK細胞即細胞因子誘導的殺傷細胞，具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤廣、識別能力強等諸多特性[6]。由樹突狀細胞(DC)和細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)構成的DC-CIK治療是近年來興起的免疫治療方案，具有高效、低毒的特性，是惡性腫瘤免疫治療的首選方案[3]。DC、CIK共培養可以相互作用，DC能夠分泌大量IL-2因子，同時CIK分泌CD3+CD56+也顯著增加，可見DC可以促進CIK細胞的成熟，增強CIK細胞毒性；CIK還能夠促進DC分泌CD80+CD86+等共刺激因子，增強腫瘤的免疫應答。CIK還能夠表達IFN-γ和TNF-α，進一步提高免疫應答效率，改善患者的睡眠狀況，從而減輕患者的抑郁狀態，提高患者的生活質量[7-9]。Sadanga等[10]應用DC治療胃腸道腫瘤患者，發現DC能夠明顯降低患者食管癌塊體積，具有較強的抑制作用。

本研究應用DC-CIK治療中晚期食管癌患者，以淋巴細胞亞群評估治療效果。研究發現，28例患者治療1周后檢查結果TH/TS范圍顯著降低，1個月后復查數值恢復至正常值，并較之前檢查結果顯著升高；CD16+CD56+治療后檢查結果較治療前均顯著上升，與既往臨床研究[6-7]結果一致。Schmidt等研究[11]報道，DC誘導培養CIK可以使CIK細胞中的免疫抑制T細胞，即Treg細胞明顯降低，削弱其對抗腫瘤免疫細胞的抑制作用，增強CIK對腫瘤的殺傷效應。本研究證實了治療后NKT細胞顯著升高，體現DC-CIK對腫瘤細胞的殺傷作用，且毒副作用較低。然而，治療后1周TH/TS值較治療前顯著降低，1個月后比值大幅度升高，CD3+、CD4+均未出現明顯變化，與既往研究[12-13]有所不同，但從另一角度反映機體出現免疫應答，患者免疫機制有所改善[14]。有研究[15]顯示，術前DC-CIK聯合化療治療食管癌后，患者癌組織中Ras、Raf、MEK、P38、c-Met等腫瘤生成和轉移因子均顯著降低，其中原癌基因c-Met能夠促進血管生成，Raf激活ERK誘導細胞發生惡性增殖，揭示了DC-CIK對癌癥治療的意義。

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中圖分類號:R 735.1

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)09-116-02

DOI:10.7619/jcmp.201609033

收稿日期:2016-01-16