新型載體PEI修飾樹脂固定化脂肪酶及其在對2-氯丙酸酯拆分中的應用

關鋒

（天津南開和成科技有限公司，天津 300270）

新型載體PEI修飾樹脂固定化脂肪酶及其在對2-氯丙酸酯拆分中的應用

關鋒

（天津南開和成科技有限公司，天津 300270）

New PEI modif ed resin immobilized lipase and its application in 2-chloropropionic acid ester split

目的：研究新型載體PEI修飾樹脂固定化脂肪酶及其在對2-氯丙酸酯拆分中的應用。方法：使用新型載體PEI修飾樹脂固定化脂肪酶，并使用固化后的脂肪酶對2-氯丙酸酯進行拆分。結果：PEI在反應溫度為34 ℃時對光學活性2-氯丙酸的生成量最佳，且固化后的脂肪酶拆分光學活性2-氯丙酸的效果最好。結論：對2-氯丙酸酯使用新型載體PEI修飾樹脂固定化后的脂肪酶進行拆分能高效的獲取光學活性的2-氯丙酸酯。

2-氯丙酸酯；脂肪酶；固化

2-氯丙酸酯作為農藥、香料、醫藥的中間體，其沸點為149 ℃ at 760 mmHg，密度為1.081 g/cm3，分子式為C5H9ClO2[1]。對于醫藥來說只有具有光學活性的2-氯丙酸酯才是制藥的關鍵成分，因此本文的主要目的就是使用新型載體PEI修飾樹脂固定化脂肪酶，并使用固化后的脂肪酶對2-氯丙酸酯進行拆分制備具有光學活性的2-氯丙酸酯，現將結果匯報如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文使用的脂肪酶主要為豬胰脂肪酶（PPL），使用的試劑主要有乙醇、二氯甲烷、2-氯丙酸酯、丙醇、磷酸二氫鈉、鄰苯二甲酸氫甲、酚酞、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉。設備有攪拌器、恒溫鍋、干燥箱、色譜儀、離子檢測器等。

1.2 實驗方法

第一步配置溶液，使用磷酸氫二鈉配置溶液A，使用磷酸二氫鈉配置溶液B，將乙醇配置為95%的濃度，將氫氧化鈉配置為0.05 mol/L濃度，將酚酞配成10 g/L的指示劑，使用A、B兩種溶液在pH為6.0的情況下配成緩沖液，緩沖液與2-氯丙酸酯、PEI修飾樹脂固定化脂肪酶在恒溫器內進行震蕩反應 形成反應液，定期進行取樣。取2 ml的反應液滴入酚酞指示劑、氫氧化鈉和乙醇，計算2-氯丙酸的生成量。使用物理吸附法對脂肪酶使用新型載體PEI修飾樹脂進行固定化。物理吸附法的方法為使用活性炭、多孔玻璃、幾丁質等吸附劑將脂肪酶吸附到PEI的表面進行酶固化處理[2]。

2 結果

PEI在反應溫度為34 ℃對光學活性2-氯丙酸的生成量最佳，且固化后的脂肪酶拆分光學活性2-氯丙酸的效果最好，詳情請見表1，表2。

表1 不同溫度對2-氯丙酸的生成量比較

表2 固化與非固化脂肪酶對2-氯丙酸拆分作用

3 討論

本文使用的物理吸附法相對于操作簡單，無需過于復雜的操作環境，可重復利用載體，但具有結合不牢固、脂肪酶易脫落的缺點。經過固化后的脂肪酶活力不僅與其制備方法有關，載體的性質也會對其活性造成一定的影響。載體可以通過改變酶生活的微環境，對酶的構型造成影響。質量較差的載體不僅會對酶的生理結構造成嚴重破壞還可對酶的活性造成影響，使酶活性降低甚至失活。

溫度之所以能對光學活性的2-氯丙酸酯的生成量造成影響，主要是因為溫度可以影響脂肪酶拆分2-氯丙酸的效率，作為影響酶反應的主要因素溫度，相關報道顯示隨著溫度的升高，2-氯丙酸的轉化率逐漸升高，但其具有最適溫度，低于或者高于此溫度都會對固定化的脂肪酶活性造成一定的影響[3]。反應時間也可對光學活性的2-氯丙酸酯的生成量造成影響，隨著反應時間的推移，2-氯丙酸酯轉化率成逐漸升高的趨勢，轉化率主要與2-氯丙酸酯和脂肪酶反應的速率有關，時間增加，反應的部分增加，反應的速率逐漸增快。

除了溫度、反應時間可影響2-氯丙酸酯的轉化率，pH、固化酶用量、固化脂肪酶的重復使用等也與2-氯丙酸酯的轉化率有關。相關報道顯示，隨著pH的增加，2-氯丙酸酯的轉化率逐漸升高，其主要的影響的是脂肪酶的解離狀態，但pH逐漸增高，脂肪固化酶催化活性有所降低，但解離狀態未發生明顯變化因而2-氯丙酸酯的轉化率仍維持在較高的水平。在適宜的pH下固化后的脂肪酶對2-氯丙酸酯的選擇性較高，因而轉化率也較高。固化酶的用量與2-氯丙酸酯轉化率呈正相關，固化脂肪酶量增多與2-氯丙酸酯可進行反應的數目會增多導致轉化率的升高[4]。對于已使用過的固化脂肪酶雖然其光活性仍較高，但并沒有初次制備的固化脂肪酶活性高，因此對于已重復使用多次的固化酶其2-氯丙酸酯的轉化率有所下降，相關報道顯示在重復使用三次以上的固化酶對2-氯丙酸酯轉化率下降較為明顯。

本文數據顯示PEI在反應溫度為34 ℃對光學活性2-氯丙酸的生成量最佳，且固化后的脂肪酶拆分光學活性2-氯丙酸的效果最好。由此可見，對2-氯丙酸酯使用新型載體PEI修飾樹脂固定化后的脂肪酶進行拆分能高效的獲取光學活性的2-氯丙酸酯。固化后的脂肪酶可利用回收，且通過過濾或者離心等簡單方法就可以進行回收，重復使用，降低了實驗的成本。固定后的脂肪酶更容易裝置成為酶柱狀，加大反應面積，適用于大規模的工業生產。固化的脂肪酶與游離脂肪酶在穩定性、選擇性上均有所提高。

綜上所述，對2-氯丙酸酯使用新型載體PEI修飾樹脂固定化后的脂肪酶進行拆分能高效的獲取光學活性的2-氯丙酸酯，建議使用高效的吸附制備固化酶的方法，因單純的制備方法可影響酶的重復使用次數和穩定性，不利于研究經費的控制。對于脂肪易溶于水的特性，不建議固化脂肪酶的制備過程在水相中進行操作。在制備過程中使用表面活化劑可提高2-氯丙酸酯的轉化率。為提高2-氯丙酸酯的轉化率，選擇合適的溫度、適宜的pH值、固化脂肪酶量、反應時間等對PEI修飾樹脂固定化后的脂肪酶拆分2-氯丙酸酯均有促進作用。

[1] 金迪.脂肪酶的固定化及其在2-氯丙酸拆分中的應用[J].浙江工業大學，2014，36(11)：28～29.

[2] 金鑫.脂肪酶催化芳基丙酸酯水解立體選擇性調控方法[J].浙江大學，2012，12(23)：152～153.

[3] 陳輝.產堿假單胞菌脂肪酶分子改造及拆分制備l-薄荷醇的研究[J].浙江大學，2014，08(06)：147～148.

[4] 劉濤. 磁性納米顆粒定向固定化脂肪酶及其應用研究[J].華中科技大學，2015，03(24)：47～50.

(P-02)

Q814

1009-797X(2016)06-0058-02

A

10.13520/j.cnki.rpte.2016.06.020

關鋒（1984-），本科，助理工程師，研究方向為固定化酶樹脂載體的研發。

2016-02-18