酶聯免疫法檢測自身免疫性肝炎I型抗纖維肌動蛋白抗體的評估

劉 玲，黃 潔，彭曉明，肖明中，李曉東

湖北省中醫院1.檢驗科；2.肝病科，湖北 武漢 430061

酶聯免疫法檢測自身免疫性肝炎I型抗纖維肌動蛋白抗體的評估

劉 玲1，黃 潔1，彭曉明1，肖明中2，李曉東2

湖北省中醫院1.檢驗科；2.肝病科，湖北 武漢 430061

目的 對使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)Ⅰ型患者抗纖維肌動蛋白抗體(AFA)進行評估分析。方法 收集163例AIH-Ⅰ型、15例AIH-Ⅱ型、36例AIH-Ⅲ型患者臨床資料及血清標本，采用ELISA法檢測患者的AFA，同時采用間接免疫熒光法(IFA)檢測患者的AFA和抗平滑肌抗體(ASMA)作為對照，對檢測結果進行統計學分析。結果 以IFA≥1∶320、ELISA≥30 U為陽性判斷標準，除AFA-ELISA與ASMA-IFA檢測AIH-Ⅱ型的陽性例數差異有統計學意義外(P=0.03)，AFA-ELISA與AFA-IFA、ASMA-IFA比較，檢測其他AIH各型患者陽性例數差異均無統計學意義(P﹥0.05)。AFA-ELISA與AFA-IFA檢測AIH-Ⅰ型的相關性比ASMA-IFA更好(r=0.97vs0.52)。AFA-ELISA與AFA-IFA相比，檢測AIH-Ⅰ型有稍高的敏感性(76.07%vs71.17%)和略低的特異性(72.55%vs78.43%)；AFA-ELISA與ASMA-IFA相比，檢測AIH-Ⅰ型有更高的敏感性和特異性(76.07%vs64.42%，72.55%vs60.78%)；AFA-ELISA 檢測AIH-Ⅰ型的約登指數與AFA-IFA相近(0.49vs0.50)，比ASMA-IFA高(0.49vs0.25)。AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的ROC面積為0.86，當濃度為54.06 U/ml時檢測的敏感性和特異性最好。結論 AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的敏感性和特異性與AFA-IFA相近，但操作更方便，與ASMA-IFA的敏感性相近，但特異性更好。AFA-ELISA可作為AIH-Ⅰ型較好的篩查方法。

自身免疫性肝炎；抗纖維肌動蛋白抗體；抗平滑肌抗體；酶聯免疫吸附試驗；間接免疫熒光法

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)Ⅰ型是一種慢性進行性肝臟疾病，免疫抑制劑能有效控制部分患者病情的發展，如果不能正確診斷和及時有效治療，最終可導致肝硬化、肝功能衰竭，因而早期準確診斷是關鍵[1]。抗纖維肌動蛋白抗體(anti-filamentous actin antibody,AFA)近年來備受關注，被認為對AIH-Ⅰ型具有較好的診斷價值[2-3]，但目前對AIH自身抗體的檢測方法亟待規范[4-5]。我們使用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測AIH患者的AFA，并將檢測結果與其他數據比較分析，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2010年12月-2014年12月湖北省中醫院確診的163例AIH-Ⅰ型、15例AIH-Ⅱ型、36例AIH-Ⅲ型肝病患者臨床資料及血清標本，AIH患者中凡伴有其他自身免疫性疾病如自身免疫性甲狀腺炎、格雷夫斯病、干燥綜合征、類風濕關節炎的均排除在外。另收集197名健康獻血者標本作為對照組，收集血清后分裝，-80 ℃凍存備用。研究對象均保留詳細的臨床資料，且簽訂知情同意書。

1.2 觀察指標(1)臨床表現：包括性別、年齡、臨床癥狀；(2)影像學檢查：觀察患者初診時肝臟情況；(3)血清生化指標檢測：丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清總膽紅素(TBil)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)、球蛋白(GLO)、免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)；(4)AIH自身抗體：ANA、AFA、ASMA；(5)肝臟組織病理學檢查：AIH、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、重疊綜合征(AIDOS)患者于診斷前行肝穿刺活檢，評價病理組織學特點。

1.3 方法

1.3.1 AIH的診斷：結合國際自身免疫性肝炎工作組(International AIH Group，IAIHG)1992年AIH診斷評分標準[6]、1999年AIH修訂診斷評分標準[7]和2008年AIH簡化評分標準[8]進行評分。主要內容有：(1)無遺傳代謝類疾病(α1抗胰蛋白酶及血清銅藍蛋白指標正常)、無活動性病毒感染、無飲酒或服用已知對肝臟有損傷的藥物史；(2)AST、ALT顯著升高，免疫球蛋白IgG升高大于正常上限；(3)自身抗體陽性，包括ANA、AFA、ASMA、抗LKM-1、抗LC-1、抗SCA/LP；(4)肝臟病理學表現以界面肝炎為主，無膽管的病理改變。

1.3.2 AIH分型：已經診斷的AIH患者參考相關標準[13]，按照患者自身抗體的檢測情況進行分型。

1.3.3 ELISA法檢測AFA：選用美國INOVA公司提供的ELISA試劑，標本用標本稀釋液1∶1稀釋后加入50 μl于反應孔內，立即加入50 μl的生物素標記的抗體。蓋上膜板輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h，甩去孔內液體，洗凈拍干。每孔加入80 μl的親和鏈酶素-HRP，37 ℃溫育30 min。甩去孔內液體，洗凈拍干。每孔加入底物A、B各50 μl，37 ℃溫育10 min。取出酶標板迅速加入50 μl終止液，在450 nm波長處測定各孔的OD值。以吸光度OD值為縱坐標(Y)，相應的α-ASMA標準品濃度為橫坐標(X)獲得相應曲線，根據OD值由標準曲線換算出濃度。濃度≥30 U判定為陽性，濃度<20 U判定為陰性，濃度20～30 U判定為可疑。

1.3.4 IFA法檢測AFA和ASMA：AFA和ASMA試劑均為歐蒙(德國)醫學實驗診斷公司生產的Hep-2細胞生物薄片。選擇Hep-2細胞、猴肝、大鼠腎、大鼠胃作基質的生物薄片，將待測血清稀釋與基質常溫孵育30 min，PBS緩沖液浸洗5 min，加異硫氰酸熒光素標記的抗體常溫孵育30 min，PBS緩沖液浸洗5 min后封片，用熒光顯微鏡觀察結果。

2 結果

2.1 一般情況及臨床表現AIH-Ⅰ型組的平均年齡為(59.26±10.24)歲，AIH-Ⅱ型組為(66.54±8.21)歲，AIH-Ⅲ型組為(63.38±12.92)歲。AIH患者中女性多于男性(女男比例3.28∶1)，大多隱襲性起病，臨床癥狀及體征各異。常見癥狀包括乏力、惡心、嘔吐、上腹部不適或疼痛、關節痛、肌痛、皮疹等。部分患者無明顯臨床癥狀及體征，只有在生化檢查出肝功能異常后才發現。少數患者表現為急性、亞急性甚至暴發性起病。

2.2 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA檢測AIH患者結果統計IFA≥1∶320、ELISA≥30 U檢測例數，AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的陽性例數與AFA-IFA、ASMA-IFA比較，差異均無統計學意義(χ2=0.25，P=0.62；χ2=1.22，P=0.27)；檢測AIH-Ⅱ型的陽性例數與AFA-IFA比較，差異無統計學意義(χ2=0.24，P=0.62)，但與ASMA-IFA比較，差異有統計學意義(χ2=5.0，P=0.03)；檢測AIH-Ⅲ型的陽性例數與AFA-IFA、ASMA-IFA比較，差異均無統計學意義(χ2=0.69，P=0.41；χ2=2.17，P=0.14)；檢測健康獻血者的陽性例數與AFA-IFA、ASMA-IFA比較，差異均無統計學意義(χ2=0.34，P=0.56；χ2=0.20，P=0.65，見表1)。

表1 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA檢測AIH患者結果[例數(%)]

注：以IFA≥1∶320、ELISA≥30 U分析同型AIH患者：*P>0.05、#P<0.05。

2.3 AFA-ELISA與AFA-IFA、ASMA-IFA檢測AIH-Ⅰ患者結果相關性分析通過SPSS 19.0相關性分析，AFA-ELISA與不同滴度ASMA-IFA的相關性為：r=0.52，0.95%CI：0.17～0.81，P<0.05(見表2)。AFA-ELISA與不同滴度的AFA-IFA的相關性為：r=0.97，0.95%CI：0.93～0.99，P<0.001(見表3)。AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型與不同滴度的AFA-IFA、ASMA-IFA都有相關性，但與AFA-IFA的相關性更好(r=0.97vs0.52)。

表2 AFA-ELISA對ASMA-IFA陽性AIH-I型患者檢測結果 [例數(%)]

表3 AFA-ELISA對AFA-IFA陽性AIH-I型患者檢測結果[例數(%)]

2.4 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA檢測AIH-Ⅰ型的性能評估將全部AIH作為統計對象，AFA-ELISA檢出的真陽性數為124例、真陰性數為37例；AFA-IFA檢出的真陽性數為116例、真陰性數為40例；ASMA-IFA檢出的真陽性數為105例、真陰性數為31例。AFA-ELISA 與AFA-IFA相比，檢測AIH-Ⅰ型有稍高的敏感性(76.07%vs71.17%)和略低的特異性(72.55%vs78.43%)；AFA-ELISA與ASMA-IFA相比，檢測AIH-Ⅰ型有更高的敏感性和特異性(76.07%vs64.42%，72.55%vs60.78%)；AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的約登指數與AFA-IFA相近(0.49vs0.50)，比ASMA-IFA高(0.49vs0.25，見表4)。

表4 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA檢測AIH-Ⅰ型的性能評估

2.5 AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的ROC曲線運用SPSS 19.0統計軟件繪制受試者工作曲線，以檢測結果的1-特異性為橫坐標，敏感性為縱坐標繪制曲線，曲線下面積為0.86，當濃度為54.06 U/ml時檢測AFA-ELISA的敏感性、特異性最好(見圖1)。

圖1 AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的ROC曲線

3 討論

隨著臨床實踐經驗的積累和對AIH-Ⅰ型認識的提高，人們逐漸認識到AIH-Ⅰ型相關性自身抗體在AIH-Ⅰ型的診斷與分型中的重要作用[9]。AIH-Ⅰ型自身抗體的臨床意義不僅體現在疾病診斷上，某些自身抗體在反映疾病活動度、監測病程、評價療效和預后判斷等方面也有重要參考指標[10-11]。

我國2010年自身免疫性肝病研討會紀要對AIH診斷的結論：ANA或ASMA≥1∶40計1分，ANA或ASMA≥1：80計2分，≥6分為可能診斷為AIH，≥7分為確定診斷AIH[12]。我們的研究顯示AFA-ELISA檢測AIH與不同滴度的AFA-IFA、ASMA-IFA都有相關性，但與AFA-IFA的相關性更好(r=0.97vs0.52)。

ASMA是傳統的用于AIH-Ⅰ型診斷的重要指標，ASMA可以識別包括微管、中間絲和微絲在內的多種細胞骨架成分，有文獻[13]顯示ASMA滴度越高，診斷AIH-Ⅰ型的敏感性越好，高滴度的ASMA對AIH-Ⅰ型診斷具有更好的靈敏度。平滑肌亞結構是微絲結構蛋白，以兩種形式存在，即單體和多聚體，多聚體形成肌動蛋白絲，稱為纖維狀肌動蛋白(F-actin)，近年使用AFA篩查AIH-Ⅰ型得到廣泛的應用[14]。AFA是AIH-Ⅰ型相關熒光模型針對的主要靶抗原，根據IFA典型的AFA熒光模型診斷AIH-Ⅰ型，可獲得比ASMA更佳的特異性和敏感性[15]。Grunwald等[16]研究得出ASMA對AIH-Ⅰ型檢測的敏感性為16%，而AFA對AIH-Ⅰ型診斷的靈敏度為71%。以IFA≥1∶320、ELISA≥30 U為陽性判斷標準，我們的研究結果顯示除AFA-ELISA與ASMA-IFA檢測AIH-Ⅱ型的陽性例數比較，差異有統計學意義外，AFA-ELISA與AFA-IFA、ASMA-IFA比較，檢測其他AIH各型患者例數差異均無統計學意義。

臨床上最常用的IFA被認為是檢測自身抗體的金標準[17]，然而AFA的操作及結果識別需要有一定經驗的操作者，這可能導致AFA的檢測質量下降。ELISA法由于其易實現自動化且不需要操作者的高技能水平，被越來越多地用來檢測AFA。本文采用IFA和ELISA兩種方法檢測自身免疫疾病患者血清AFA，以IFA法作為金標準研究ELISA法檢測AFA的性能，并探討兩者之間的相關性，發現AFA-ELISA檢測AIH型與不同滴度的AFA-IFA、ASMA-IFA都有相關性，但與AFA-IFA的相關性更好(r=0.97vs0.52)。由于AFA-ELISA的檢測方法簡單易行，適合無IFA操作經驗的人員開展工作，值得推廣。

目前我國臨床實驗室檢測AIH 自身抗體的質量不高，檢測方法亟待規范[4-5]，從我國154家實驗室檢測ASMA的統計結果可知IFA法檢測ASMA的陽性符合率為57.3%，陰性符合率為96.8%[18]，這個結果不是太理想，臨床急需敏感性更高檢測AIH-Ⅰ型的自身抗體。目前由于AIH-Ⅰ型的發病機制尚不清楚，自身抗體是病理損傷的結果還是原因尚無定論，所以自身抗體AFA檢測只能作為AIH-Ⅰ型診斷的參考依據[19]。我們的研究顯示AFA-ELISA 與AFA-IFA相比，檢測AIH-Ⅰ型有稍高的敏感性(76.07%vs71.17%)和略低的特異性(72.55%vs78.43%)；AFA-ELISA與ASMA-IFA相比，檢測AIH-Ⅰ型有更高的敏感性和特異性(76.07%vs64.42%，72.55%vs60.78%)；AFA-ELISA 檢測AIH-Ⅰ型的約登指數與AFA-IFA相近(0.49vs0.50)，比ASMA-IFA高(0.49vs0.25)，AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的ROC面積為0.86，按照ROC曲線評價標準(AUC在0.7～0.9時有較高的準確性)，AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的方法有可行性。

總之，AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型的敏感性和特異性比ASMA-IFA好，AFA-ELISA檢測AIH-Ⅰ型與AFA-IFA的敏感性和特異性相近，但前者不需要操作者的高技能水平，因此，AFA-ELISA可作為AIH-Ⅰ型的較好篩查方法，值得推廣應用。

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(責任編輯：王全楚)

Evaluation on anti-filamentous actin antibodies with the enzyme-linked immunosorbent assay in autoimmune hepatitis type I patients

LIU Ling1, HUANG Jie1, PENG Xiaoming1, XIAO Mingzhong2, LI Xiaodong2

1. Department of Clinical Laboratory; 2. Department of Liver Diseases, Hubei Provincial Hospital of TCM, Wuhan 430061, China

Objective To evaluate anti-filamentous actin antibodies (AFA) with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in autoimmune hepatitis type I (AIH-Ⅰ) patients. Methods Two hundred and fourteen consecutive untreated AIH patients (163 cases of AIH-Ⅰ, 15 cases of AIH-Ⅱ, 36 cases of AIH-Ⅲ) and 197 blood donors (controls) from Dec. 2010 to Dec. 2014 were collected. AFA was detected with ELISA, detecting AFA and anti-smooth muscle antibodies (ASMA) with indirect immunofluorescence assay (IFA) were compared. The results were statistically analyzed with SPSS 19.0. Results There was significant difference in AIH-Ⅱ patients between AFA-ELISA and ASMA-IFA (P=0.03);there was no any significant difference in other AIH patients between AFA-ELISA and AFA-IFA or ASMA-IFA (IFA≥1∶320, ELISA≥30 U). AFA-ELISA was both correlated with different titers of AFA-IFA and ASMA-IFA, but the correlation was better in AFA-IFA than ASMA-IFA for AIH-Ⅰ patients (r=0.97vs0.52). In prospective analysis, AFA-ELISA showed a similar sensitivity, specificity and Youden index but operation easier than AFA-IFA. A superior sensitivity (76.07%vs64.42%), superior specificity (72.55%vs60.78%) and superior Youden index (0.49vs0.25) compared with ASMA-IFA. The area under the curve ofROCof AFA-ELISA was 0.86, and when the concentration was 54.06 U/ml, the detection sensitivity and specificity were the best. Conclusion AFA-ELISA is a useful diagnostic method in AIH-Ⅰ patients, which is easier operated than AFA-IFA, and superior sensitivity and specificity than ASMA-IFA.

Autoimmune hepatitis; Anti-filamentous actin antibody; Anti-smooth muscle antibody; Enzyme-linked immunosorbent assay; Indirect immunofluorescence assay

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.016

國家中醫臨床研究基地業務建設科研專項課題基金(JDZX2012051)

劉玲，碩士，研究方向：肝病致病機理及臨床診斷學

李曉東，主任醫師，教授，研究方向：肝病。E-mail: deng13098855103@163.com

R575.1

A

1006-5709(2016)06-0658-05

2015-05-17