精氨酸改性殼聚糖納米纖維膜的制備及其BSA親和吸附性能研究

王良安，莊旭品,2，晁貴群，徐先林,2，董 鋒

(1.天津工業(yè)大學，天津 300387；2.天津工業(yè)大學先進復合材料教育部重點實驗室，天津 300387)

精氨酸改性殼聚糖納米纖維膜的制備及其BSA親和吸附性能研究

王良安1，莊旭品1,2，晁貴群1，徐先林1,2，董 鋒1

(1.天津工業(yè)大學，天津 300387；2.天津工業(yè)大學先進復合材料教育部重點實驗室，天津 300387)

文章通過改變反應物的摩爾比，合成不同取代度的殼聚糖精氨酸(CS-Arg)產(chǎn)物，應用FTIR、TG及元素分析對其結構及取代度進行表征。進一步將其和聚乳酸混合溶解，利用溶液噴射紡絲法制備CS-Arg納米纖維(CANFs)，以牛血清蛋白為模型蛋白，研究了CANFs對BSA的吸附性能，結果表明：A4(CANFs-4)親和膜對BSA的吸附能力最好，吸附量達445.19 mg/g。

納米纖維親和膜；蛋白質(zhì)吸附；溶液噴射紡絲；殼聚糖；精氨酸

1 引言

蛋白質(zhì)是生命有機體的主要成分，其產(chǎn)品在醫(yī)藥、催化、醫(yī)學診斷及疾病治療等領域有著廣泛的應用[1]。近年來，隨著生命科學、藥學及醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，對蛋白質(zhì)、酶、抗體等生物大分子的分析、分離純化的要求越來越高。如何有效地分離提純不同蛋白質(zhì)成為現(xiàn)在藥物分析和生物科學的研究熱點之一。

殼聚糖(Chitosan, CS)是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，是一類生物相容性好、可降解、天然無毒的線性多糖生物高分子。殼聚糖分子中含有自由的氨基和多個羥基，易進行羥基化、醚化、酰基化、烷基化及季銨化改性[2]。通過接枝改性的方法，在殼聚糖大分子骨架上選擇性地接枝易于加工、強度高的、親水性的、具有特殊功能的小分子，可有效改善殼聚糖的性能。Xu等[3]利用溶膠凝膠反應制備負載二氧化硅殼聚糖多孔有機質(zhì)，其能快速吸附BSA，吸附量達到980 mg/L。Chen等[4]利用殼聚糖/羧甲基纖維膜、殼聚糖/羧甲基殼聚糖層析、吸附、分離卵白蛋白、溶解酵素。Jayakumar等[5]通過EDC做引發(fā)劑成功地將2-羥乙基膦酸接枝到CS上，得到的磷酸化殼聚糖衍生物具有良好的水溶性，也為本論文的殼聚糖衍生物合成方法提供了重要的依據(jù)。EDC是一種小分子交聯(lián)劑，廣泛用于羧基與氨基的交聯(lián)。本實驗方法就是利用接枝聚合反應，使殼聚糖與精氨酸發(fā)生酰化反應，將殼聚糖的氨基與精氨酸的羧基耦合在一起，形成共聚物。反應所得精氨酸修飾的殼聚糖具有更好的親和吸附性能。

親和膜分離技術是以膜作為基質(zhì)，并對其表面進行改性，在膜的內(nèi)外表面固定特定的配基，再對生物大分子進行分離純化的技術。與傳統(tǒng)親和色譜相比，親和膜分離技術具有高選擇性、快速分離、操作條件溫和、無污染和易放大的特點。納米纖維內(nèi)部貫通的孔洞和非常大的比表面積是人們將其應用于親和膜的關鍵原因[6]。通過合成高分子材料與天然高分子材料混紡成膜，所得的材料具有機械性能好、化學穩(wěn)定性高、可反應官能團豐富等優(yōu)點，非常適合做蛋白質(zhì)分離純化的親和膜基材。

2 實驗

2.1 主要試劑與儀器

酶標分析儀：北京普朗新技術有限公司；氣浴恒溫振蕩器：金壇市科杰儀器廠；真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)實驗儀器有限公司。

2.2 精氨酸殼聚糖(CS-Arg)的制備

將上述1 g殼聚糖溶于100 mL 1%的冰醋酸中，用磁力攪拌器攪拌至殼聚糖完全溶解。稱取0.71 g NHS加入殼聚糖溶液攪拌半小時，再稱取0.96 g EDC加入到上述溶液繼續(xù)攪拌至溶解[7]。后將精氨酸加入溶液中，繼續(xù)攪拌24 h使反應充分完全。精氨酸與殼聚糖的摩爾比分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1五組，依次編號為1、2、3、4、5。精氨酸改性殼聚糖合成路線如圖1所示。

圖1 精氨酸改性殼聚糖合成路線

將透析袋侵入蒸餾水中10 min使其充分吸水，將已反應好的五組溶液裝入透析袋中用蒸餾水透析1～2天，期間每隔6 h換一次蒸餾水。然后換用聚乙二醇(PEG)作透析液，把透析袋再放入18%的PEG溶液中濃縮，濃縮一天，更換一次透析液。最后將溶液倒入培養(yǎng)皿中，放入冰箱中冷藏預冷凍30 min，轉入冷凍干燥機中冷凍12 h，得到改性好的殼聚糖。

2.3 CS-Arg/PLA納米纖維膜的制備

稱取相同質(zhì)量的CS-Arg固體和PLA顆粒溶解在三氟乙酸溶液中，配制成總濃度為4 wt%的CS-Arg/PLA溶液，先用玻璃棒攪拌均勻，再在磁力攪拌器上攪拌過夜備用。

采用溶液噴射紡絲技術制備CS-Arg/PLA納米纖維(CANFs)[8～12](如圖2所示)，其基本紡絲流程如下：將配制好的混合溶液裝入到一個容積為10 mL的注射器中，用膠皮管連接注射器和針頭，針頭直徑為0.3 mm，進液速度為10 mL/h，壓力為0.05 MPa。紡絲完成后，將得到纖網(wǎng)放入60℃的熱鼓風干燥箱中烘燥3 h，去除殘留的三氟乙酸。然后把干燥好的纖網(wǎng)用熱壓機熱壓，溫度設為100℃，壓力為5 MPa，得到平整和有一定機械強度的納米纖維親和膜。CANFs不同取代度的纖維膜CANFs-(1，2，3，4，5)，依次編號為A1、A2、A3、A4、A5。

圖2 溶液噴射紡絲實驗裝置示意圖

2.4 CS-Arg樣品的結構與性能表征

采用TENSOR37型紅外光譜儀對CS-Arg樣品試樣進行紅外測試，粉末測試方法采用KBr壓片法；用熱分析儀測定樣品的熱穩(wěn)定性能，在固定氮氣氣氛下以10℃/min的加熱速率從環(huán)境溫度加熱到800℃；使用VARI0EL3型元素分析儀測定樣品(確定樣品已烘干至恒重)的碳、氮、氫三種元素的含量，并計算精氨酸的接枝率。

2.5 CANFs納米纖維膜的測試

2.5.1 掃描電鏡(SEM)測試

取少許納米纖維樣品噴金后在掃描電鏡(SEM)下觀察其微觀形貌，采用隨機抽樣的方法。

2.5.2 BSA的吸附量測試

利用酶標分析儀測定562 nm處每個試樣的吸光度值，并根據(jù)標準曲線計算剩余蛋白濃度，由式(1)得到BSA 的吸附量。

q=[(Ci-Ct)V]/m

(1)

試中：q—BSA的吸附量(mg/g)；

V—蛋白質(zhì)溶液體積，取10mL；

Ci—BSA溶液的初始濃度(mg/mL)；

Ct—BSA溶液的平衡濃度(mg/mL)；

m—膜的干重(g)。

3 結果與討論

3.1 CS-Arg的結構表征

CS-Arg的進行紅外光譜圖如圖3所示。在殼聚糖的紅外光譜中，2867 cm-1的弱吸收峰對應著-CH-的伸縮振動，伯氨(-NH2)彎曲特征振動峰和吡喃環(huán)上C-O-C的非對稱伸縮振動分別在1590 cm-1、1151 cm-1。對于精氨酸：1614 cm-1對應精氨酸特有基團胍基(-CH4N2)的吸收峰[13]，1419 cm-1和1130 cm-1的吸收峰分別是由于COO-的對稱彎曲、C-C-N 的不對稱彎曲。

與精氨酸和殼聚糖的紅外圖譜對比，新合成的精氨酸改性殼聚糖衍生物的紅外圖譜有明顯的變化。胍基基團的吸收峰在1636 cm-1和C-C-N 的不對稱彎曲的吸收峰在1150 cm-1，也可以看到殼聚糖吡喃環(huán)C-O骨架伸縮振動帶出現(xiàn)在1068 cm-1～1027 cm-1，另外在1557 cm-1附近為仲氨彎曲振動特征吸收峰，伯氨(-NH2)彎曲特征振動峰在精氨酸改性殼聚糖之后消失，是由于殼聚糖分子的中的氨基與精氨酸的α-羧基脫水形成肽鍵，生成仲胺[14]，初步說明了殼聚糖精氨酸改性成功。

圖3 精氨酸、殼聚糖以及CS-Arg產(chǎn)物的紅外圖譜

CS-Arg的TG曲線如圖4所示，可以看出CS-Arg的熱分析圖分為三個失重階段：第一個階段溫度在20℃～150℃之間，是由于附屬和結合水的蒸發(fā)；第二個階段溫度在150℃～375℃之間，是失重最大的階段。當溫度達到270℃時失重達到最大，是由于CA中的酰胺鍵斷裂，碳鏈斷裂，CA逐步降解；第三個階段溫度在375℃～800℃之間，在這個階段，小分子基團繼續(xù)斷裂，進一步降解直至重量穩(wěn)定。曲線(A5)不同于曲線(A1)、(A2)、(A3)、(A4)所變現(xiàn)出來的規(guī)律，是由于精氨酸是過量的，精氨酸發(fā)生了自交聯(lián)。從表1中可以看出，這五個不同摩爾比CS-Arg的失重率大致相當。

表1 CS-Arg三個階段的失重率

樣品第一階段(%)第二階段(%)第三階段(%)A113.0940.5419.83A211.8143.8614.65A311.6643.9513.29A411.1645.1712.44A511.6345.6313.41

圖4 不同摩爾比CS-Arg的TG曲線

根據(jù)碳氮的比例來計算產(chǎn)物CS-Arg的取代度。假設原料殼聚糖中，脫乙酰度為DD，取代度為DS，則CS-Arg中碳和氮的百分比C%/N%為：

其中DD為殼聚糖的脫乙酰度(DD=0.92)，DS為取代度。

不同摩爾比的CS-Arg的元素分析結果見表2。由表2可見，殼聚糖的接枝率在16%～44%之間，有較高的接枝率。由表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著精氨酸的量增加，精氨酸殼聚糖的取代度也隨之增大，這是因為精氨酸的量增加，則殼聚糖單元的氨基被接枝的幾率增加，從而產(chǎn)物的取代度增大，但當精氨酸增加一定程度(精氨酸與殼聚糖的摩爾比為3∶1)時，接枝率不再增加，這是因為精氨酸過量了，沒有多余的殼聚糖與之結合，造成部分精氨酸與精氨酸之間的自組合。

表2 殼聚糖以及CS-Arg產(chǎn)物的C、N、H元素含量

3.2 CANFs納米纖維膜的測試

3.2.1 CANFs納米纖維膜的形貌分析

圖5(A1-A5)為不同取代度CANFs電鏡形貌圖，其中A1、A2、A3、A 4、A5依次為精氨酸取代度為16.6 %、22.9 %、34.2 %、43.7 %和8.3 %的纖維形貌圖。

圖5 不同取代度的CANFs電鏡圖及直徑分布

由圖可以看出，纖維整體形態(tài)良好，蓬松多孔，呈現(xiàn)三維卷曲形態(tài)；纖維平均直徑分布在100 nm～200 nm之間，但隨著取代度的不同纖維直徑稍微發(fā)生細微的變化，隨著取代度的增加，纖維直徑稍微變大。從圖(A5)中明顯看出有少許液滴，圖(A1、A2、A3、A4)中則基本沒有出現(xiàn)液滴的情況，這是因為圖(A5)中含過量的小分子精氨酸再加上本身CS-Arg材料不易成纖維，聚乳酸的輔助成纖作用削弱，導致表面張力過大不易拉伸成纖，出現(xiàn)液滴的情況，而其他四個則相反，無小分子干擾，CS-Arg和聚乳酸混合溶液具有可紡條件所具備的粘度和分子量，在紡絲拉伸過程中完全呈纖維狀，則會形成無液滴形貌良好的纖維。由纖維形貌可以看出，這種雜亂無章平鋪形成的三維卷曲結構有較大的比表面積和更高的孔隙率，這種結構會降低液體的流動阻力，同時其卷曲微孔延長了流體穿行路徑，增加與纖維表面接觸碰撞的幾率，提高了截留效率，也提高了纖維表面親和配基的利用率，以上都會增加對蛋白質(zhì)的吸附能力。

3.2.2 CANFs親和膜對蛋白質(zhì)吸附的影響

配基數(shù)量是影響吸附研究的重要因素之一，精氨酸作為配基接枝到殼聚糖上由于其取代度的不同，最終吸附量也會不同，一般是取代度越大其吸附量越大呈正相關關系。取代度不同的CANFs親和膜對蛋白質(zhì)吸附的影響見圖6。

圖6 取代度不同的CANFs親和膜對蛋白質(zhì)吸附的影響

由圖6可知，吸附量隨著取代度的增加而增加。配基存在的情況下，最低吸附量達到了295.36 mg/g，也具備良好的吸附性能；A4試樣制備的CANFs-4親和膜精氨酸的取代度最高，蛋白質(zhì)的吸附量最大，吸附量達到445.19 mg/g。由此可以得出，CANFs親和膜具有良好的吸附性能，且與精氨酸的取代度存在正相關關系，殼聚糖本身對蛋白質(zhì)就有良好的親和吸附性，再加上配基的固載使吸附性能得到進一步提高。精氨酸的存在提供了胍基基團，胍基上氮原子和氫原子很多，對肽有高度的親和性，容易形成氫鍵作用，胍基含有正電荷基團能與蛋白質(zhì)形成靜電作用，所以制備的CANFs親和膜的吸附性能比較好，具有很好的應用前景。

4 結語

納米纖維親和膜對蛋白質(zhì)吸附性能的研究越來越受關注，納米纖維內(nèi)部貫通的孔洞和大的比表面積是其應用于親和膜的關鍵。本文基于溶液噴射紡絲技術，制備CANFs親和膜進行蛋白質(zhì)吸附性能測試。五種CANFs親和膜(A1、A2、A3、A4、A5)中A4(CANFs-4)親和膜對BSA的吸附能力最好，吸附量達445.19 mg/g。隨著生物工程和生命科學的迅速發(fā)展，生物大分子的分離純化越來越重要，該研究具有廣闊的應用前景。

[1] 王子佳，李紅梅，弓愛君，等.蛋白質(zhì)分離純化方法研究進展[J].化學與生物工程. 2009，26(8)：8—11.

[2] 張峰. 殼聚糖基多孔膜材料的研究[D].上海：復旦大學，2012.

[3] Xu XY，Dong PJ，F(xiàn)eng Y，et al. A Simple Strategy for Preparation of Spherical Silica-supported Porous Chitosan Matrix Based on Sol-gel Reaction and Simple Treatment with Ammonia Solution[J].Analytical Methods，2010，2(5)：546—551.

[4] Liu YZ，F(xiàn)eng ZC，Shao ZZ，et al. Chitosan-Based Membrane Chromatography for Protein Adsorption and Separation[J].Materials Science and Engineering，2012，32(6)：1669—1673.

[5] Jayakumar R，Reis RL，Mano JF. Phosphorous Containing Chitosan Beads for Controlled Oral Drug Delivery[J].Journal of Bioactive & Compatible Polymers，2006，21(4)：327—340.

[6] 閔明華，石建高，馬海有，等.納米纖維親和膜應用研究進展[J].合成纖維，2013，42(3)：20—23.

[7] Yin L，Su T，Chang J，et al. Arginine and Acrylonitrile Modified Chitosan Nanoparticles for Anticancer Drug Delivery[J].Nano Brief Reports & Reviews，2014，09(07)：1450075.

[8] 楊小燦，莊旭品，史少俊，等.溶液噴射法制備聚丙烯腈基納米碳纖維的研究[J].高科技纖維與應用， 2013, 38(2)：14—19.

[9] Jia K，Zhuang X，Cheng B，et al. Solution Blown Aligned Carbon Nanofiber Yarn as Supercapacitor Electrode[J].Journal of Materials Science: Materials in Electronics，2013，24(12)：4769—4773.

[10] Yan G，Zhuang X，Tao X，et al. Solution Blowing of Silicon Carbide Nanofiber and its Thermal Stability[J].Science of Advanced Materials，2013，5(3)：209—215.

[11] Zhuang X，Jia K，Cheng B，et al. Solution Blowing of Continuous Carbon Nanofiber Yarn and its Electrochemical Performance for Supercapacitors[J].Chemical Engineering Journal，2014，237(1)：308—311.

[12] Liu R，Xu X，Zhuang X，et al. Chitosan/PVA Hydrogel Nanofiber Mats[J].Carbohydrate Polymers， 2014，101(30)：1116—1121.

[13] Zhou C，Ye H，Wang H，et al. Coordination of L-Arginine and Iron Cation Improves Stability of Hemoglobin Concentrates[J].European Food Research and Technology，2015，240(4)：743—751.

[14] 王召占.氨基和羧基改性磁性殼聚糖的制備及其吸附性能研究[D].青島：青島科技大學，2014.

Preparation of Chitosan Modified L-arginine Nanofibers Membrane and its Application in Affinity Sorption for BSA

WangLiangan1,ZhuangXupin1，2,ChaoGuiqun1,XuXianlin1，2,DongFeng1

(1.Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387, China；2.Key Laboratory of Advanced Textile Composite Materials of Ministry of Education of Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China)

In this paper, a series of chitosan-arginine(CS-Arg) with different substitution degrees were prepared by changing the molar ratio of arginine to chitosan. Chemical structure and morphology of CS-Arg were characterized through FTIR, TG and elemental analysis. CS-Arg nanofibers(CANFs) were successfully fabricated via solution blowing of CS-Arg and polylactic acid mixed. It was evaluated the adsorption characteristic of CANFs for bovine serum albumin(BSA). The adsorption capacity of A4(CANFs-4)affinity membrane for BSA was the best, which reached to 379.43 mg/g.

nanofiber affinity membrane; protein adsorption; solution blowing; chitosan; arginine

2016-11-06

國家自然科學基金資助項目(51473121)

王良安(1990—)，男，山東菏澤人，碩士研究生。

TQ342+.86

B

1009-3028(2016)06-0001-05