精漿Na+-K+-ATP酶及降鈣素基因相關肽與男性精子質量相關研究

黃　群，梁朝榮，韋高猛，孟冬冬

(右江民族醫學院附屬醫院泌尿外科，百色 533000)

HUANG Qun,LIANG Chaorong,WEI Gaomeng,MENG Dongdong

(Department of Urology,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China)

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論著

精漿Na+-K+-ATP酶及降鈣素基因相關肽與男性精子質量相關研究

黃群，梁朝榮，韋高猛，孟冬冬

(右江民族醫學院附屬醫院泌尿外科，百色 533000)

【摘要】目的探討精漿Na+-K+-ATP酶、降鈣素基因相關肽(CGRP)與男性精子質量的相關性。方法參照第5版《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準，將研究對象分為無精子癥組、少精子癥組、少弱精子癥組、弱精子癥組、死精子癥組及正常對照組，通過雙抗體夾心法檢測精漿中Na+-K+-ATP酶及CGRP的濃度，研究精漿中Na+-K+-ATP酶及CGRP與男性精子質量的相關性。結果比較不同精液質量組(無精子組、少精子組、少弱精子組、弱精子組、死精子組)間精漿中Na+-K+-ATP酶的濃度差異均無統計學意義(P>0.05)。比較不同精液質量組間精漿中CGRP的濃度差異均無統計學意義(P>0.05)。結論精漿中Na+-K+-ATP酶的濃度及降鈣素基因相關肽的濃度與精子質量可能均無相關性。

【關鍵詞】精漿Na+-K+-ATP酶；降鈣素基因相關肽；精子質量

在男性不育的病因中，以精子質量下降占首要。Ca2+是細胞內精子能動性的重要調節因子，低濃度的Ca2+可促進精子的能動性，相反高濃度Ca2+降低精子的能動性。降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene-related peptid,CGRP)[1]是應用DNA基因重組和分子生物技術研究發現的。有關研究表明CGRP能維持細胞Ca2+穩定，降低細胞膜對Ca2+的通透性，從而影響細胞內外鈣離子的濃度水平，具有調節血流和胃腸運動功能的作用[2]。精子質膜上存在Ca2+-ATP酶和Na+/Ca2+交換系統，調節細胞內鈣離子濃度[3]。Na+-Ca2+交換體轉運離子的動力來源于Na+-K+-ATP酶轉運帶來的膜兩側Na+的濃度差。為了解Na+-K+-ATP酶、CGRP與精子質量間的關系，我們對不同精子質量的精漿中的Na+-K+-ATP ase和CGRP進行研究，探討其間的相關性。

1對象與方法

1.1研究對象從2014年1～9月期間因不育癥(夫妻結婚后同居1年以上，有規律性生活，未采取任何避孕措施，因男方因素造成女方不孕者)來我院就診的男性患者中隨機選取無精癥17例、少精癥18例、少弱精癥30例、弱精癥55例、死精癥26例作為病例組。排除睪丸、附睪、輸精管的異常及遺傳性、血管性、惡病質等疾病導致的繼發性不育患者。另外選擇具有正常生育史，身體健康，性生活及精液檢查均正常的34例男性作為正常對照組。研究對象均在知情情況下自愿參與該實驗研究。

1.2分組標準以WHO的標準進行分組：(1)正常精液：精液量1.5～6 ml,pH 7.2～8.0，液化時間<60 min，精子密度≥15×106/ml，精子活力a+b級比例≥32%或a+b+c級比例≥40%；(2)無精子癥的標準為：經離心沉淀精液中未見精子；(3)少精子癥的標準為：精子密度<15×106/ml且>0；(4)弱精子癥的標準：精子活力a+b級比例<32%或a+b+c級比例<40%；(5)少弱精子癥的標準：少精子且弱精子癥；(6)死精子癥：無活精子，全為死精子。

1.3實驗方法

1.3.1儀器及試劑CGRP酶及人ATP酶酶聯免疫分析試劑盒(生產商U.S.A TSZ biological trade Co.Ltd)、計算機輔助精液分析系統、光學顯微鏡、微型離心機、酶標儀(芬蘭儀器型號352型)。

1.3.2精液標本的收集依照第5版《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》的標準規定進行操作，在留取精液前所有研究對象均禁欲3～7 天，作息飲食正常，在本院以手淫法收取精液標本于專用的取精杯中。隨后精液標本將放置于恒溫為37℃水浴箱中，待精液完全液化后，先在光學顯微鏡下常規觀察分析，然后取2 ml精液量進行計算機輔助精液分析。將余下精液用微型高速離心機以3000×g速度離心15 min后分離出精漿、精子，留取精漿(光學顯微鏡下觀察內無精子)收集于EP管中冷凍于-80℃冰箱待統一檢測。

1.3.3精液常規檢查以人工常規精液分析及計算機輔助精液分析檢測精子濃度、活力等相關參數，每份標本檢測均由兩位資歷經驗豐富的檢驗工作人員校正核對。

1.3.4精漿ATP酶及CGRP濃度的檢查實驗原理雙抗體夾心法:將抗體包裝在固相載體微孔板，加入待檢精漿標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗滌液洗去未結合的物質，存留抗原-抗體復合物，后加入抗原的HRP酶標記抗體，再洗去未結合的酶標抗體，加底物TMB顯色，用酶標儀測量顯色后的溶液吸光度，通過標準曲線計算樣品中抗原濃度。精漿中CGRP檢測實驗步驟：(1)稀釋標準品以試劑盒提供原倍標準品和標準稀釋液，按表1進行操作。(2)加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μl，待測樣品孔中先加樣稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl(樣品最終稀釋度為5倍)。(3)溫育：用封板膜封板后至37℃溫育30分鐘。(4)配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋備用。洗滌：揭掉封板膜，丟棄液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。(5)加酶：每孔加入酶標試劑50 μl，空白孔除外。重復以上溫育及洗滌操作，顯色每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘，終止每孔加終止液50 μl，終止反應。用酶標儀測定吸光度：以空白孔液體調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。(6)計算：以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制出標準曲線及直線回歸方程式，根據樣品OD值計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。同理行ATPase酶的檢測。

2結果

弱精組、少弱精組、無精組、死精組、少精組及正常組的患者年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。各組精漿中CGRP及Na+-K+-ATP酶檢測結果的組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1　標準品配置稀釋步驟

表2　各組年齡、精漿中CGRP及Na+-K+-ATP酶的比較

3討論

男性不育在精液常規常表現為精子數量上減少甚至為無精，精子運動上活性減弱甚至死精。精子的活力性與精子的獲能密切相關，但精子獲能過程中相關的復雜分子機制目前尚未完全探明，而近來研究表明Ca2+在精子一系列獲能反應中扮演著重要的調節角色[4]。Ca2+內流引起精子內游離鈣離子濃度改變而起作用[5]。相關研究發現，海膽精子的線粒體內增加鈣離子濃度，降低鉀離子濃度，提高線粒體內氧化磷酸化偶聯效率，增加能量產出，精子的運動活性得以提高[6]。精子內鈣離子來自內源性鈣庫的釋放(比如位于精子鞭毛中段內線粒體鈣庫等)及外源性獲取。細胞內線粒體的鈣離子釋放途徑有鈉離子依賴的鈣離子釋放比如Na+/Ca2+交換體及非鈉離子依賴性鈣離子釋放如H+/Ca2+交換體等[7]。Na+/Ca2+及H+/Ca2+交換體繼發性轉運動力來源于Na+-K+-ATP酶轉運帶來的膜兩側Na+的濃度差。精子細胞膜上鈣泵及鈣離子通道是外源性鈣離子重要的調節途徑。鈣離子通道的類型包括電壓依賴性鈣通道、遞質門控通道比如環核苷酸門控通道、精子陽離子通道(CatSper)等。目前CatSper[8]鈣離子通道經細胞膜片鉗子技術證明存在人精子膜，并被認為是精子上最重要的鈣通道。相關研究表明CatSper鈣離子通道、環核苷酸門控通道與精子活性密切相關[5，9]。CGRP及其受體主要存在于中樞和周圍神經系統，相關報道表明CGRP能降低細胞內Ca2+水平，通過對細胞膜Ca2+通透性改變而發揮作用，從而調節細胞內Ca2+，進而維持細胞的生理功能。CGRP與細胞上相應受體結合，促使細胞內環腺苷酸(cAMP)增多，促發一系列反應后活化蛋白激酶G，激活Ca2+-ATP酶進而降低細胞內游離鈣離子[10]。Vignini等研究報道：比較弱精組和正常組的精子內Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性差異顯著[11]。由此可見精子細胞的這兩種ATP酶的活性與精子的活性密切相關。喹巴因是一種天然的Na+-K+-ATP酶特異性阻斷劑，其可通過與精子細胞Na+-K+-ATP酶特異性結合后降低精子運動。Na+-K+-ATP酶的α4亞基是在人成熟的精子尾部特異性表達[12]，可能參與精子運動的調控，對精子運動有著十分重要的作用。

本研究結果顯示，各組精漿中CGRP比較差異無統計學意義，推測精子上可能缺乏其受體，導致精漿中CGRP與精子運動無相關性。另外各組間精漿中Na+-K+-ATP酶含量比較也無統計學意義，說明精漿中Na+-K+-ATP酶與精子質量無明顯相關性。推測精漿中CGRP、Na+-K+-ATP酶可能需要進入精子細胞內，通過對精子細胞內的線粒體等進行調節而發揮作用。本實驗研究僅檢測精漿中CGRP、Na+-K+-ATP酶，未檢測精子(精子質膜及精子內)的CGRP、Na+-K+-ATP酶，故尚不可完全性排除CGRP、Na+-K+-ATP酶與精子質量的相關性，所以精子中CGRP、Na+-K+-ATP酶與精子質量的相關性有待于進一步研究。

參考文獻

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(編輯：梁明佩)

A study on correlation between seminal plasma Na+-K+-ATP ase and calcitonin gene related peptide and sperm quality in men

HUANGQun,LIANGChaorong,WEIGaomeng,MENGDongdong

(DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate correlation between seminal plasma Na+-K+-ATP ase and calcitonin gene related peptide(CGRP) and sperm quality in men.MethodsAccording to the standard of the fifth edition of “WHO Human Semen Examination and Treatment of Laboratory Manual”,research objects were divided into azoospermia group,oligospermia group,oligoasthenozoospermia group,asthenospermia group,necrospermia group and control group.Then,correlation between seminal plasma Na+-K+-ATPase and CGRP and sperm quality in men was studied through detecting the concentration of Na+-K+-ATP ase and CGRP in seminal plasma by double antibody sandwich method.ResultsDifference of the concentrations of Na+-K+-ATP ase of seminal plasma in different semen quality groups (azoospermia group,oligospermia group,oligoasthenozoospermia group,asthenospermia group,necrospermia group and control group) was not statistically significant(P>0.05).In addition,difference of the concentration of CGRP in seminal plasma among different semen quality groups was not statistically significant(P>0.05).ConclusionNeither concentration of Na+-K+-ATP ase of seminal plasma nor concentration of CGRP may not be correlated with quality of sperm.

【Key words】Na+-K+-ATP ase in seminal plasma;CGRP;quality of sperm

(收稿日期：2015-06-12修回日期：2016-04-29)

中圖分類號：R698.2

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.02.001

作者簡介：黃群，男，主任醫師，醫學學士，研究方向：泌尿及男性生殖系統。E-mail:huangqundao@163.com

基金項目：廣西醫療衛生重點科研課題(重2012082)；廣西壯族自治區衛生廳自籌經費科研課題(Z2012724)