三陰乳腺癌組織表皮生長因子受體表達及其與微血管密度和微淋巴管密度的相關性

文顯梅　周木秀　郭　勇　黨夢婷　趙　旬　余　龍　汪曉鋮

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三陰乳腺癌組織表皮生長因子受體表達及其與微血管密度和微淋巴管密度的相關性

文顯梅周木秀郭勇黨夢婷趙旬余龍汪曉鋮

【摘要】目的：檢測表皮生長因子受體(EGFR)在三陰乳腺癌(TNBC)患者癌組織中的表達及與癌組織中微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLVD的相關性。方法：應用免疫組化法檢測48例TNBC癌組織EGFR表達及MVD和MLVD，分析EGFR的表達程度與MVD和MLVD的相關性。結果：TNBC患者癌組織中的EGFR陽性表達率為66.67%(32/48)，其中(+)和(+ +)者各4例(8.33%)，(+ + +)者9例(18.75%)，(+ + + +)者15例(31.25%)，EGFR陽性表達與其MVD 和MLVD呈顯著正相關(P<0.01)。結論：TNBC癌組織高表達EGFR及高MVD和高MLVD，從而影響腫瘤生物學行為及患者預后；抗EGFR靶向治療可能使患者獲益。

【關鍵詞】三陰乳腺癌；表皮生長因子受體；微血管密度；微淋巴管密度

三陰乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer，TNBC) 即雌激素受體(ER) 、孕激素受體(PR) 、人表皮生長因子受體2(HER-2) 均為陰性的乳腺癌，約占乳腺癌總數的10%-17%[1]。其發病年齡較早，具有高侵襲性、局部復發和遠處轉移等特點，預后差。表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR) 是存在于細胞膜表面的一種酪氨酸激酶受體，具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，TK) 活性，可參與正常乳腺組織生長發育調節，對惡性腫瘤細胞的生長調控也起重要的作用。有研究[2]表明，TNBC患者EGFR表達率較非TNBC患者高，可能是TNBC的重要標志物和有效治療靶點[3]。同時，血管和淋巴管的生成作為腫瘤生長和轉移的重要條件已被公認，微血管密度(Microvessel Density,MVD)和微淋巴管密度(Micro Lymphatic Vessel Density,MLVD)業已成為血管和淋巴管生成的兩個重要參數,但研究TNBC癌組織EGFR表達與MVD和MLVD相關性的報道尚少。因此，本文觀測分析EGFR和MVD、MLVD在TNBC癌組織中的表達及其相關性，進一步探討TNBC的發生發展機制，為臨床治療提供實驗依據。

1資料與方法

1.1病例資料

收集本院于2005-01-01-2015-01-31手術切除的乳腺癌患者乳腺癌標本48例，所有患者均為女性，平均年齡45歲，腫瘤大小約2cm3，術前均未行抗腫瘤治療，術后常規病理檢查顯示38例為浸潤性導管癌，10例為非浸潤性導管癌，免疫組化檢查ER、PR及HER-2 均陰性；所有患者均無遠處轉移，9例患者有同側腋窩淋巴結轉移。

1.2主要試劑和儀器

三種受體檢測用鼠抗人單克隆抗體(批號：ER，MAB-0062；PR，MAB-0216；HER-2，MAB-0198)和EGFR鼠抗人單克隆抗體(批號：MAB-0196)以及血管、淋巴管內皮細胞標記用鼠抗人單克隆抗體(批號：CD34，kit-0004；D2-40，MAB-0567)均購自福州邁新公司；免疫組化SP及DAB試劑盒(批號：GK500705、GK417016)購自美國基因公司；PBS緩沖液、EDTA抗原修復液及一抗稀釋液均購自北京中杉金橋公司；二甲苯、酒精、雙氧水、蘇木素均為本實驗室制備。El-350-2 石蠟包埋機(Microm公司，德國)；RM2135 切片機(Leica公司，德國)；BM51型倒置顯微鏡(Olympus公司，日本) 。

1.3檢測指標和方法

1.3.1檢測方法：所有乳腺組織均以5%甲醛溶液固定，石蠟包埋，3μm厚度連續切片，烤干，于二甲苯溶液及梯度濃度乙醇中脫蠟至水。各免疫組化指標檢測步驟按試劑盒說明書操作，采用已知陽性片進行對照，以PBS 液代替一抗作為空白對照。然后依次蘇木素淡染細胞核、鹽酸酒精分化、返藍、脫水透明，最后中性樹膠封片。

1.3.2ER、PR、HER-2陽性判斷標準[4]：ER、PR計數的乳腺癌細胞中，有>10%癌細胞核內見棕色顆粒為陽性；HER-2計數的乳腺癌細胞中，有>10%的細胞膜出現連續性棕黃色為陽性。

1.3.3EGFR陽性判斷標準[5]：癌細胞胞質及胞膜出現棕黃色或棕褐色顆粒為EGFR陽性細胞，依據陽性細胞著色強度分值和陽性細胞百分率分值之和進行半定量評分。著色強度: 無棕黃色為0分，棕黃色較淺為1分，清晰棕黃色為2分，棕黃色較深為3分。陽性細胞百分率及評分: 先用低倍鏡 (×40)尋找到著色最強區域，然后用高倍視野 (×400) 計數400個腫瘤細胞中呈棕黃色的細胞，不見棕黃色細胞計0分，棕黃色細胞< 10%為1分，棕黃色細胞占10%-30%計2分，棕黃色細胞占31%-49%計3分，棕黃色細胞≥50% 計4分。上述兩項相加,0-2分者為EGFR陰性(-)，3分及3分以上為EGFR陽性，其陽性程度為3分(+)，4-5分(++)，6分(+++)，7分(++++) 。

1.3.4MVD和MLVD判斷標準：按照Weidner等[6]方法，先用低倍視野(×40)找到乳腺癌組織內MVD / MLVD最大的區域，然后換高倍視野(×200)，通過計算機圖像分析系統在監視器上計數微血管或微淋巴管數目。CD34染色陽性的單個內皮細胞或內皮細胞簇均作為1支微血管計數，血管管腔面積大于8個紅細胞直徑者不予計數，每張切片計數5個視野，取平均值作為1例標本的MVD。D2-40染色陽性的單個內皮細胞或內皮細胞簇計為一個微淋巴管，每張切片計數3個視野，取平均值作為該標本的MLVD。

以上免疫組化染色結果均由兩位具備多年病理診斷經驗的技術人員采用雙盲法判讀。

1.4統計學處理

2結果

免疫組化結果顯示ER、PR及HER-2在TNBC患者癌組織中表達均為陰性。

2.1EGFR在TNBC癌組織中的表達

EGFR在乳腺癌中央區和邊緣區表達無明顯差異。48例TNBC中32例(66.67%)呈陽性表達；有淋巴結轉移的9例患者中8 例(88.89%)呈陽性表達，無淋巴結轉移的39例患者中24例(61.54%)呈陽性表達。EGFR陽性表達程度分布為：(+) 4 例(8.33%)，(++) 4 例(8.33%)，(+++) 9例(18.75%)，(++++)15例(31.25%)。見圖1。

2.2TNBC癌組織的MVD和MLVD

MVD和MLVD在TNBC癌組織癌巢周邊較高，EGFR(-)及不同程度EGFR陽性癌組織MVD、MLVD差異有統計學意義(P<0.05),且EGFR陽性程度越高(+—++++)，MVD和MVLD也漸次增加(圖2、表1)。等級相關分析表明，EGFR陽性程度與MVD和MLVD 呈顯著正相關(rMVD=0.793，rMLVD=0.875，P<0.01)。

表1　不同程度EGFR的TNBC癌組織中MVD和MLVD比較

[本文圖1、圖2見封2]

3討論

TNBC作為乳腺癌的特殊亞型，內分泌治療和靶向治療均無顯著療效，目前臨床主要采用化療，但是療效并不理想，病死率高[7]。所以尋找TNBC的有效靶點以及研究其抑制劑已成為近年臨床研究新熱點。

EGFR 作為一種酪氨酸激酶活性的膜受體，其配體有轉化生長因子-2α(TGF-2α)、表皮生長因子(EGF)、雙調蛋白(Amphiregulin，AR)等，配體受體結合形成二聚體，激活內在酪氨酸激酶，促進細胞從G1 期到S 期，從而在細胞增殖中發揮重要作用。已有研究表明，EGFR過度激活可以促使乳腺惡性腫瘤細胞增殖、轉移以及腫瘤血管生成并抑制凋亡[8]。

血管生成對惡性實體腫瘤的生長、轉移及預后都有相當重要的意義[9]。Sharma 等[10]指出，MVD對預測實體腫瘤侵襲和轉移以及預后方面有顯著意義。作為目前標記MVD最主要的CD34，其廣泛分布于血管內皮細胞，具有較高的特異性和敏感性。還有研究[11]顯示乳腺淋巴結轉移過程中主要是瘤體邊緣功能較強的新生淋巴管起作用，而單克隆抗體D2-40 對淋巴管內皮具有很強的特異性和敏感性[12],可作為理想的淋巴管內皮標記物,而準確計數淋巴管,可作為研究腫瘤淋巴管生成與腫瘤生物學行為間關系的良好指標。本實驗結果表明，TNBC患者EGFR陽性表達率是66.67%，且EGFR陽性程度與MVD和MLVD呈顯著正相關，證明EGFR確實在TNBC的新生血管和淋巴管形成中起重要作用，與有關研究[13]的結論相一致，也為尋找新的治療方案提供了依據。有鑒于抗血管療法具有副作用小，不容易產生耐藥性等優點，目前抗血管療法在腫瘤治療中已成為新的熱點[14]，如抗血管生成聯合抗HER-2治療胃癌即有較好的療效[15]。目前常用抗EGFR過表達藥物有厄洛替尼、西妥昔單抗、小分子酪氨酸激酶抑制劑TKIs等[16]，其對TNBC療效如何，需要進一步觀察驗證。

綜上所述，本實驗結果表明TNBC癌組織的EGFR高表達，MVD及MLVD增加，兩者呈顯著正相關，為闡明EGFR對TNBC的惡性生物學行為及MVD和MLVD在其中的重要作用，也為臨床應用抗EGFR靶向治療提供了一定的依據。

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文顯梅(1978-)，女，漢族，醫學碩士，主治醫師，主要從事腫瘤病理診斷

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Expression of EGFR and Its Relationship with Microvessel Density and Micro Lymphatic Vessel Density in Triple-negative Breast Carcinoma

WEN Xian-mei,ZHOU Mu-xiu,GUO Yong-Dang,MENG ting,ZAO Xun,YULong,WANG Xiao-cheng

Department of Pathology, The 161st Central Hospital of the People's Liberation Army, Wuhan 430010,China

【Abstract】Objective: To detect the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR)and the correlations with microvessel density(MVD )and micro lymphatic vessel density( MLVD) in triple negative breast cancer( TNBC). Method: Expressions of EGFR, MVD and MLVD were detected in 48 cases of triple negative breast cacer tissues by immunohistochemical method，and the correlation between them was analyzed respectively. Results: The positive rates of expression of EGFR in triple negative breast cacer was up to 66.67%(32/48), in which the (+) and the (++)was 4 cases (8.33%) respectively, the (+++)was 9 cases (18.75%) and the (++++) was 15 cases (31.25%), the expression of EGFR showed significant positive correlation with MVD and MLVD (P<0. 01) .Conclusion: EGFR showed high expression in cancerous tissue of TNBC,which can increase MVD and MLVD in them and affect the tumor biological behavior and prognosis of patients finally. So it is possible that treatment targeting EGFR could make patients with TNBC benefit.

【Key words】Triple negative breast carcinoma;Epidermal growth factor receptor；Microvessel density；Micro lymphatic vessel density

[中圖分類號]R737.9

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2016)02-0005-04

第一作者簡介：本文

[作者單位]中國人民解放軍第161醫院病理科，武漢 430010

本文2015-12-06收到，2016-03-15修回