喉鱗狀細(xì)胞癌患者視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1異常表達(dá)

曾漢榮　楊虹女　李文星　涂　興　李志華　孔維佳

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喉鱗狀細(xì)胞癌患者視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1異常表達(dá)

曾漢榮1楊虹女1李文星2涂興3李志華2孔維佳3

【摘要】目的：探討喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)患者視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1(Cyclin D1)的異常表達(dá)及其相關(guān)性。方法：選擇36例喉部疾病手術(shù)患者，包括LSCC(LSCC組)、聲帶息肉(息肉組)和癌前病變(癌前組)各12例，各組均于手術(shù)后取病變組織，采用Western-blotting檢測(cè)pRb和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組兩指標(biāo)差異及相關(guān)性。結(jié)果：與息肉組比較，癌前組pRb表達(dá)水平降低(P<0.01)，Cyclin D1表達(dá)水平升高(P<0.01)；與癌前組比較，LSCC組pRb水平更低(P<0.01)，Cyclin D1水平更高(P<0.01)。三組pRb與Cyclin D1蛋白水平均呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.94、-0.83和-0.92，P均<0.01)。結(jié)論：LSCC的發(fā)生和發(fā)展與pRb表達(dá)降低和Cyclin D1表達(dá)增加有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】喉鱗狀細(xì)胞癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白；細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1

喉癌(Laryngeal Carcinoma, LC)是耳鼻咽喉-頭頸外科常見(jiàn)惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%-7.6%，以喉鱗狀細(xì)胞癌(Laryngeal Squamous Cell Carcinoma, LSCC)最多，約占LC的96%-98%，死亡率高[1]。吸煙、酗酒、環(huán)境污染、病毒感染等多種因素是LSCC發(fā)生的主要原因，其分子生物學(xué)機(jī)制可能與原癌基因的激活及腫瘤抑制基因失活、轉(zhuǎn)錄失調(diào)等密切相關(guān)[2]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Retinoblastoma Protein, pRb)是一種重要的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤中發(fā)生突變或缺失[3]，當(dāng)致瘤RNA取代轉(zhuǎn)錄因子E2f，占據(jù)pRb口袋時(shí)，即破壞pRb正常功能，削弱pRb/E2f調(diào)控細(xì)胞增殖作用。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1(Cyclin D1)是一種生長(zhǎng)因子感受器和細(xì)胞周期正向調(diào)控因子[4]，負(fù)責(zé)細(xì)胞周期進(jìn)展中G1/S轉(zhuǎn)換，一旦Cyclin D1表達(dá)異常上調(diào)，組織細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)無(wú)序增加。研究認(rèn)為L(zhǎng)SCC可能與pRb抑癌功效降低和/或Cyclin D1表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)[5]。但目前有關(guān)pRb/Cyclin D1在LSCC發(fā)生中表達(dá)程度和相關(guān)性的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)LSCC、聲帶息肉(Vocal Cord Polyp, VCP)和癌前病變(Laryngeal Precarcinoma Lesions，LPL)組織的pRb和Cyclin D1表達(dá)水平并分析其相關(guān)性，探討pRb和Cyclin D1對(duì)LSCC發(fā)病機(jī)制的作用及對(duì)臨床診斷和治療的意義。

1資料與方法

1.1臨床標(biāo)本和分組

2014-05—2015-05在枝江市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院，經(jīng)電子喉鏡、頸部MRI增強(qiáng)掃描、頸部及腹部超聲和喉部病變組織活檢等常規(guī)檢查后，確定手術(shù)治療患者36例，分別接受喉部手術(shù)，摘除病灶組織迅速用生理鹽水沖洗，去除血跡，旋即用無(wú)菌手術(shù)刀切取病變組織的中心部位后平分為二，一部分置于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，由三位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)鏡檢；另一部分立即置于-80℃液氮凍存，待檢pRb和Cyclin D1表達(dá)水平。組織病理學(xué)明確診斷36例樣本中LSCC 12例(LSCC組，男9例，女3例，年齡42-79歲，平均60.50±12.30歲；且既往無(wú)喉部手術(shù)史；手術(shù)前沒(méi)有接受任何放療、化療或免疫治療；不伴不典型增生；無(wú)并發(fā)其它癌癥及急慢性疾病史)，聲帶息肉12例(息肉組，男7例，女5例，年齡40-65歲，平均52.50±9.60歲)，癌前病變12例(癌前組，分別為喉角化病、喉黏膜白斑病、疣狀增生等，男9例，女3例，年齡57-77歲，平均67.00±10.20歲)。三組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)枝江市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循患者知情同意原則。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1儀器：高速臺(tái)式低溫離心機(jī)(MMLT-XIR，Thermo公司，美國(guó))；-80℃超低溫冰箱(MDF-U53V，Sanyo公司，日本)；酶標(biāo)儀(Synergy HF，Bio-tek公司，美國(guó))；垂直電泳儀(PowerPacTM HC, Bio-Rad公司，美國(guó))；Western Blot轉(zhuǎn)移電泳儀(XCell SureLock， Invitrogen公司，美國(guó))；雙通道熒光掃描儀(ODY-2182，Li-Cor公司，美國(guó))；紫外凝膠成像系統(tǒng)(VL，Vilber公司，法國(guó))；Teflon梳子，NC膜和Wortman濾紙等。

1.2.2試劑：兔抗人pRb和Cyclin D1單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司(批號(hào)：20150605)；二奎啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司(貨號(hào)：8817-423)；溴酚藍(lán)、蛋白質(zhì)電泳Marker、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗人單克隆抗GAPDH抗體(批號(hào)：20151423)、考馬斯亮藍(lán)G-250、丙烯酰胺、TBST緩沖液、脫脂奶粉均購(gòu)自美國(guó)sigma公司；T-Per組織蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑等購(gòu)自美國(guó)Pierec或Roche公司。

1.3Western-blotting技術(shù)檢測(cè)組織pRb/Cyclin D1蛋白表達(dá)

從-80℃冰箱中取出標(biāo)本，加入10g組織樣本到冰凌包繞的預(yù)存有1ml組織蛋白裂解液和20μl蛋白酶抑制劑的EP管中(10mg/100μl組織裂解液)，用勻漿器勻漿，12 000rpm和4℃條件下離心5min后，置于4℃條件下保存10min待用。應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。蛋白表達(dá)檢測(cè)用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，通過(guò)灌膠、上樣(Marker和待測(cè)提取液各50μl)、電泳，獲得帶有蛋白條帶的分離膠。在分離膠上標(biāo)記方向，用一張NC膜和兩張Wortman濾紙按濾紙-凝膠-NC膜-濾紙平鋪于支撐墊上轉(zhuǎn)膜2h，完成后將NC膜置于TBST緩沖液浸洗5min，再放于含5%脫脂奶粉的膜封閉液中振蕩2h。分別加入適量兔抗人pRb和Cyclin D1單克隆抗體(各為1∶200)以及兔抗人單克隆抗GAPDH抗體(內(nèi)參照)，振蕩后溫育2h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)

溫育1h， DAB顯色，用紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描和攝像，將目的蛋白電泳條帶與GAPDH條帶在同一張膜上比較后擬合繪圖和定量分析，兩者積分光密度(OD)比值分別代表pRb和Cyclin D1表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

息肉組、癌前組和LSCC組pRb蛋白和Cyclin D1蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。pRb蛋白表達(dá)依次降低，LSCC組最低；而Cyclin D1蛋白表達(dá)依次升高，LSCC組最高。兩兩比較，癌前組pRb積分OD比值明顯低于息肉組(t=8.31,P<0.01)，LSCC組更低于癌前組(t=7.17,P<0.01)。癌前組Cyclin D1蛋白表達(dá)高于息肉組(t=5.19,P<0.01)，LSCC組高于癌前組(t=3.28,P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。相關(guān)性分析顯示，各組pRb與Cyclin D1的蛋白表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.94、-0.83和-0.92，P均<0.01)。

圖1　不同病變組織pRb和Cyclin D1的表達(dá)

組 別pRbCyclinD1息肉組1.95±0.380.28±0.17癌前組1.09±0.291)0.86±0.331)LSCC組0.32±0.092)1.78±0.632)F值36.7862.51

注：與息肉組比較，1)P<0.01；與癌前組比較，2)P<0.01

3討論

喉癌中，以發(fā)生于喉腔黏膜上皮組織的LSCC最常見(jiàn)，好發(fā)于50-70歲人群，男性多于女性[6]。LSCC是一種細(xì)胞周期紊亂性疾病，分子生物學(xué)機(jī)制可能與原癌基因激活及腫瘤抑制基因失活、轉(zhuǎn)錄失調(diào)等基因表達(dá)異常密切相關(guān)[2]。在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，分子水平的癌基因與抑癌基因就可能已出現(xiàn)了異常變化，通過(guò)檢測(cè)癌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)，可為喉癌的早期發(fā)現(xiàn)和分子診斷提供量化依據(jù)[7]。

pRb是抑癌基因Rb的表達(dá)產(chǎn)物，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、大腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)異常，其缺失和突變均影響細(xì)胞增殖調(diào)控[8]。Cyclin D1是周期素蛋白家族關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞周期中發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞中Cyclin D1拷貝數(shù)增加、染色體重排及基因多態(tài)性改變時(shí)，正常組織細(xì)胞新舊更替失去控制，可導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生[9]。本文采用Western-blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LSCC患者pRb表達(dá)顯著減少，Cyclin D1表達(dá)明顯增加，異常程度均較息肉組織和癌前病變組織嚴(yán)重。表明LSCC發(fā)生后，處于細(xì)胞周期G1/S調(diào)控中心部位的pRb活性嚴(yán)重降低，而控制細(xì)胞增殖G1中期的關(guān)鍵蛋白Cyclin D1異常增加，最終造成腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。pRb和Cyclin D1兩種分子標(biāo)志物的異常變化，可以為喉癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供靶標(biāo)，將喉組織惡變趨勢(shì)消除在萌芽狀態(tài)[10,11]。

pRb和Cyclin D1表達(dá)水平檢測(cè)為闡述LSCC發(fā)生機(jī)制提供了分子學(xué)證據(jù)，本文相關(guān)性分析顯示，無(wú)論息肉組、癌前組和LSCC組，其pRb蛋白表達(dá)與Cyclin D1蛋白表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)，提示LSCC的發(fā)生與pRb和Cyclin D1的此消彼漲關(guān)系密切。pRb抑癌功能失活和Cyclin D1調(diào)控細(xì)胞增殖加速，決定了喉部組織惡變的程度[12]，其作用機(jī)制可能為當(dāng)患者喉部的宿主細(xì)胞遭受外來(lái)分裂刺激因素的激活和放大后，處于細(xì)胞分裂增殖G1/S調(diào)控點(diǎn)(G1/S Checkpoint)中心部位的pRb進(jìn)行性減少，激活細(xì)胞周期控制蛋白Cyclin D1過(guò)表達(dá)，并與細(xì)胞周期依賴性激酶結(jié)合，磷酸化pRb，導(dǎo)致與pRb結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F與pRb分離；而游離的E2F可充分發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，激活有關(guān)基因，使喉組織細(xì)胞跨過(guò)G1/S checkpoint，由G1期向S期演進(jìn)，引起細(xì)胞增殖。而且低磷酸化的pRb還可能刺激Cyclin D1轉(zhuǎn)錄、合成和活化，導(dǎo)致pRb更進(jìn)一步磷酸化，從而在G1晚期形成一反饋環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)Cyclin D1進(jìn)一步過(guò)度表達(dá)，阻斷干擾素產(chǎn)生，增加外源DNA的整合及突變，抵抗細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞永生化，最終造成喉組織細(xì)胞增殖失控而促進(jìn)LSCC的發(fā)生[13]。

綜上所述，LSCC 的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)控中心的pRb降低和Cylin D1增加密切相關(guān)，呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性。提示臨床疑診LSCC時(shí)，檢測(cè)標(biāo)本組織中pRb和Cyclin D1表達(dá)水平，有利于佐證臨床診斷和分析發(fā)病原因及機(jī)制。而且癌前喉組織pRb和Cyclin D1表達(dá)的檢測(cè)或可為L(zhǎng)SCC的早期預(yù)防和治療提供分子靶標(biāo)。

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曾漢榮(1963—)，男，漢族，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉-頭頸外科疾病的臨床防治

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The Abnormal Expressions of pRb and Cyclin D1 in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma Patients

ZENG Han-rong1, YANG Hong-nu1, LI Wen-xing2, TU Xing3, LI Zhi-hua2, KONG We-jia3

1Department of Otolaryngology, The People’s Hospital of Zhijiang City, Zhijiang 443200,China;2Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,China;3School of Life Science of Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China

【Abstract】Objective: To investigate the abnormal expressions of retinoblastoma protein (pRb) and cell cycle protein D1 (Cyclin D1) in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) patients.Method: All pathological specimens, which were respectively included 12 cases of LSCC group and vocal cord polyp (VCP group) as well as laryngeal precarcinoma lesions (LPL group) were selected from patients, who were accepted radical surgery treatments because of different diseases of laryngeal tissures. The expression of pRb and Cyclin D1 were detected by Western-blotting methods. Moreover, correlational difference between different proteins were analyzed and compared by used statistical software in the mentioned above three groups.Results: Compared with VCP group, the expression of pRb was markedly decreased (P<0.01), and the expression of Cyclin D1 was notably increased in LPL group (P<0.01). Compared with LPL group, however, the quantitative levels of pRb was furtherly decreased (P<0.01), moreover, the quantitative levels of Cyclin D1 was significenlly increased in LSCC group (P<0.01). The expression of pRb had significant negative correlation with that of Cyclin D1 with -0.94 in VCP group and -0.83 in LPL group as well -0.92 in LSCC group (P of all <0.001).Conclusion: The occurrence and development of patients with LSCC might have significant relationship with that pRb was severely decreased and Cyclin D1 was significantly increased.

【Key words】Laryngeal squamous cell carcinoma; Retinoblastoma protein; Cell cycle protein D1

[中圖分類號(hào)]R739.65

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-1740(2016)02-0066-04

第一作者簡(jiǎn)介：本文

[作者單位]1湖北省枝江市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科， 枝江 443200；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430060；3華中科技大學(xué)同濟(jì)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430022

本文2016-02-02收到，2016-03-11修回