地塞米松對異丙腎上腺素所致小鼠急性心肌損傷及脾臟T細胞亞群的影響

張嚴高　余　磊　王建莉　朱閩湘　尹戴佳佳

13093795532@163.com

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地塞米松對異丙腎上腺素所致小鼠急性心肌損傷及脾臟T細胞亞群的影響

張嚴高1余磊2王建莉2朱閩湘3,*尹戴佳佳1

13093795532@163.com

【摘要】目的：觀察地塞米松(DEX)對異丙腎上腺素(ISO)致小鼠急性心肌缺血損傷的影響，并探討其作用機制。方法：16只昆明種小鼠隨機分成正常對照組(CON組)、ISO組、DEX預處理組(DEX+ISO組)、DEX后處理組(ISO+DEX組)，每組各4例。ISO組腹腔注射ISO(5mg/kg)，1次/天，連續3天；DEX+ISO組于ISO注射前30min腹腔注射DEX(1.25mg/kg)，連續3天；ISO+DEX組于實驗第2天和第3天腹腔注射ISO后30min，再腹腔注射DEX(1.25mg/kg)；CON組腹腔注射等量生理鹽水，連續3天。實驗第4天，各組小鼠心臟采血檢測血清谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)；摘取心臟進行HE染色，觀察各組心肌組織形態學改變；摘取脾臟，流式細胞術檢測脾組織勻漿T細胞亞群分布。結果：(1)與CON組比較，ISO組AST、LDH、CK均顯著升高(P<0．01)；心肌組織損害明顯加重(P<0．01)；脾組織CD8+、CD4+CD69+T細胞表達上升(P<0．05，P<0.01)。(2)與ISO組比較，DEX+ISO組AST、CK、LDH、CK-MB均下降(P<0．05或P<0.01)；心肌組織損害明顯改善(P<0．01)；脾組織CD4+、 CD8+T細胞表達顯著下降(P<0．01)，CD4+CD69+T細胞表達顯著上升(P<0．01)。(3)與ISO組比較，ISO+DEX組CD8+T細胞表達下降(P<0．05)，其余均無明顯變化(P>0．05)。結論：DEX預處理可以明顯改善ISO致小鼠急性心肌缺血損傷，其作用機制可能與DEX介導的T細胞亞群免疫應答功能改變有關。

【關鍵詞】地塞米松;異丙腎上腺素;心肌損傷;CD4+;CD8+;CD69+；小鼠

1材料與方法

1.1實驗動物、藥品及主要試劑和儀器

昆明種小鼠，雄性，體質量20-22g，浙江大學實驗動物中心提供[合格證號2007000580817，許可證號SCXK(滬)2012-0002]。ISO注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號131003);DEX注射液(湖北天藥藥業股份有限公司，批號1408231)。谷草轉氨酶(AST) 檢測試劑盒(北京執誠公司, 批號ZCAPRN012)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號3102511)；肌酸激酶(CK)檢測試劑盒(批號403281A)；肌酸激酶同功酶(CK-MB)檢測試劑盒(批號404213D)均為北京利德曼公司產品。全自動生化分析儀(日本日立公司,7180型)。流式細胞儀(美國Becton Dickinso公司)；Anti-CD4 FITC antibody(美國Ebioscience公司，克隆號RM4-4，批號E00087-1632)；Anti-CD8a APC antibody(美國Ebioscience公司，克隆號53-6.7；批號B177121)；Anti-CD69 PE antibody(美國Ebioscience公司，克隆號H1.2F3， 批號B177121)。

1.2動物分組處理

將16只小鼠隨機分為正常對照組(CON組)、ISO模型組、DEX預處理組(DEX+ISO組)、DEX后處理組(ISO+DEX組)，各組均4只。ISO組先行腹腔注射生理鹽水(1.25ml/kg)30min后腹腔注射ISO(5mg/kg)，1次/天，連續3天；DEX+ISO組將生理鹽水改為DEX 1.25mg/kg腹腔注射，余同ISO組，連續3天；ISO+DEX組在實驗第2天和第3天ISO注射30min后再腹腔注射DEX 1.25mg/kg；CON組腹腔注射等量生理鹽水，連續3天。

1.3檢測指標和方法

實驗第4天，各組小鼠用10g/L戊巴比妥鈉(50g/kg)腹腔注射麻醉，在超凈工作臺中進行心臟取血(2ml)后斷頭處死小鼠，迅速摘取心臟和脾臟。分別測定血清心肌酶學指標AST、LDH、CK、CK-MB水平，觀察心臟組織形態學和心肌損傷程度，分析脾組織中T細胞亞群CD4+、CD8+、 CD69+分布。

1.3.1心肌酶學指標血清水平測定:全血以3 500 rpm離心15min，分離血清，轉置于-20℃低溫冰箱批檢。采用臨床生化常規方法測定AST、LDH、CK及CK-MB。

1.3.2心臟組織形態學觀察和心肌損傷程度分級:離體心臟以4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、間斷連續切片(厚約5μm)，HE染色，光鏡下觀察各組小鼠心肌組織學變化。心肌病理損傷程度參照Ro-na等的方法[4]進行分級，0級：心肌細胞排列緊密，橫紋清晰，心肌纖維染色均勻，核居中，間質未見血管擴張及炎細胞浸潤，組織間隙無水腫，無出血壞死，心外膜、心內膜無異常，計0分；I級：心肌細胞排列稀疏，間質血管擴張及少量炎細胞浸潤，肌漿分布不均，心肌間質水腫，無出血，可見心肌散在的點狀壞死，主要為凝固性壞死灶，局限在心內膜下，計2分；II級：部分心肌壞死灶呈片狀分布，灶間無連接，病變累及心壁全層，間質可見血管擴張及炎細胞浸潤，有灶性出血，心肌間質有炎性出血及心肌間質水腫，計4分；III級：心肌廣泛性大片壞死，灶間相互連接累及心壁全層，有明顯間質血管擴張、水腫、出血及炎細胞浸潤，計6分。每只小鼠隨機選取3張切片，計算得分均值為該只小鼠所得分值。

1.3.3脾臟組織中T細胞亞群分析：采用流式細胞術進行檢測。取離體脾臟剝除表面結締組織被膜后，在200目不銹鋼網中輕輕研磨，PBS液洗滌2次后加Tris-NH4Cl液裂解紅細胞，再洗滌并調整細胞濃度為1×106/100μl。取上述各組單個核細胞懸液100μl加入CD4、CD8、CD69熒光抗體，常規設置平行空白對照，4℃避光孵育30min,PBS洗三遍后，用流式細胞儀檢測小鼠脾臟單個核細胞的T細胞亞群(殺傷性T細胞即CD4+T、 抑制性T細胞即CD8+T、激活的殺傷性T細胞即CD4+CD69+T、激活的抑制性T細胞即CD8+CD69+T)。

1.4統計學處理

2結果

2.1各組心肌酶學指標比較

單因素方差分析顯示各組AST、LDH、CK、CK-MB水平組間差異均有統計學意義(P<0．01)。與CON組比較，ISO組AST、LDH、CK均明顯升高(P<0．01)，CK-MB無明顯改變(P>0．05)；與ISO組比較， 而DEX+ISO組AST、LDH、CK、CK-MB均明顯下降(P<0．05或P<0.01)，ISO+DEX組AST、LDH、CK、CK-MB水平差異均無統計學意義(P>0．05)。見表1。

表1　各組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平比較均=4)

注：與CON組比較,1)P<0．01；與ISO組比較,2)P<0．05，3)P<0．01

2.2各組心肌組織病理學改變

HE染色顯示，CON組心肌細胞排列整齊、致密，胞質著色均勻，胞核清晰，間質細胞無增生，未見炎性滲出、無水腫(圖1A)。ISO組心肌細胞體積增大呈圓形或類圓形，排列紊亂，細胞核固縮深染，血管和心肌細胞之間可見纖維增多、炎性細胞浸潤、少許淋巴細胞浸潤，少量紅細胞外滲，多處見局灶性壞死(肌溶解、核消失或不著色)(圖1B)。ISO+DEX組肌纖維間充血水腫明顯，可見少許正常肌纖維；多處見肌溶解、核消失或不著色的局灶性壞死，炎性細胞浸潤不明顯(圖1C)。DEX+ISO組心肌損害較ISO組明顯減輕，可見殘存正常肌纖維明顯增多(核圓形、有核仁，胞漿深紅色)，局灶性壞死明顯減少呈散在點狀，肌纖維排列紊亂改善，血管和心肌細胞之間未見纖維增多、炎性細胞浸潤、淋巴細胞浸潤(圖1D)。心肌損傷程度評分定量分析顯示，四組總分差異有統計學意義(F=51.67,P<0．01)。 ISO組(4.00±0.00)顯著高于CON組(0)(t=12.49,P<0．01)，DEX+ISO組(2.00±0.00)顯著低于ISO組和ISO+DEX組(3.50±0.00)(t=6.24、6.10，P<0．01)，ISO+DEX組與ISO組差異無統計學意義(t=1.56,P>0．05)。

2.3各組脾臟組織T細胞亞群分布比較

各組脾臟的CD4+、CD8+、 CD4+CD69+、 CD8+CD69+T細胞流式細胞檢測結果見圖2、圖3、 圖4。方差分析顯示，四組CD4+、CD8+、 CD4+CD69+T細胞表達差異有統計學意義(P<0．01),CD8+CD69+T細胞表達差異無統計學意義(P>0．05)。ISO組CD8+、CD4+CD69+T細胞較CON組表達上升(P<0．05，P<0.01)，CD4+、CD8+CD69+T細胞表達與CON組差異無統計學意義(P>0.05)。與ISO組比較，DEX+ISO組CD4+、CD8+T細胞表達明顯降低(P<0．01)，CD4+CD69+T細胞表達明顯上升(P<0．01)。ISO+DEX組CD8+T細胞較ISO組有所下降(P<0．05)，CD4+、CD4+CD69+、CD8+CD69+T細胞表達與ISO組差異均無統計學意義(P>0．05)。見表2。

圖2　各組脾臟CD4+、CD8+T細胞表達(流式細胞術，n=4)

圖3　各組脾臟CD4+CD69+T細胞表達(流式細胞術，n=4)

圖4　各組脾臟CD8+CD69+T細胞表達(流式細胞術，n=4)

表2　各組脾臟T細胞CD4+、CD8+、CD69+表達的比較(均n=4,%)

注：與CON組比較，1)P<0．05,2)P<0．01；與ISO組比較，3)P<0．05，4)P<0．01

[本文圖1見封3]

3討論

目前認為ISO誘導的心肌損傷與心肌相對缺血缺氧、膜通透性改變、氧自由基損傷等有關[5]。AST、CK、LDH水平及心肌病理學改變是評價心肌細胞損害程度的重要指標[6]。本研究采用連續注射ISO使心肌氧化應激劇增促進氧自由基聚集，細胞膜通透性增高，肌漿內的可溶性酶大量釋放入血，導致血清心肌酶AST、LDH、CK水平顯著升高，心肌局灶性壞死明顯，與以往研究[4,6]相符。

研究表明，DEX預處理可減輕缺血再灌注后心肌損傷程度，減少炎性因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、干擾素-α(IFN-α)的表達，使炎癥反應控制在一定的水平[7,8]。本文觀察了DEX預處理及后處理對急性心肌缺血損傷效應，結果顯示，DEX預處理組心肌損傷較ISO組明顯減輕，DEX后處理組心肌損傷較ISO組無明顯改變，證實DEX預處理對ISO致小鼠急性心肌缺血損傷具有明顯保護作用，而損傷后給予DEX治療則無保護作用。

CD4+T細胞和CD8+T細胞都是炎性T細胞，通過分泌細胞因子來調節機體免疫功能，起到誘導和輔助細胞免疫及體液免疫的作用。CD69于T淋巴細胞激活后最早表達，通過抑制機體炎癥反應，調節機體免疫平衡，同時可作為共刺激信號促進T細胞進一步活化和增殖[9]。有研究表明急性心肌梗死患者淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8功能長期嚴重失調，降低了機體免疫功能，引起心肌損傷和心室重塑[10]；應用外源性生物反應調節劑調節CD3、CD4、CD8表達水平可以輔助治療[11]。本文流式細胞分析結果顯示，ISO損傷后小鼠脾臟組織CD8+和CD4+CD69+T細胞表達均有上升，而且心肌組織有大量炎性細胞浸潤，提示這些T細胞參與了心肌損傷的病理過程。經DEX預處理的小鼠脾臟組織CD4+和CD8+T細胞均顯著下降，抑制性T細胞CD4+CD69+表達顯著上升，心肌炎性細胞減少，表明DEX預處理可能對損傷心肌細胞起到重要保護作用。但另外一種抑制性T細胞 CD8+CD69+T細胞表達無明顯變化，對此現象有待進一步觀察論證。DEX后處理組只表現為CD8+T細胞表達下降，其余T細胞表達無明顯變化。因此認為DEX預處理對免疫功能的改變是其對心肌缺血缺氧保護作用重要機制之一。

綜上所述,在ISO所致急性心肌缺血損傷中，DEX預處理可以明顯改善心肌損傷,而DEX后處理沒有這種作用。該結果提示DEX可預防ISO介導的心肌損傷，其作用機制可能與DEX介導的T細胞亞群免疫應答功能改變有關。同時也為DEX預處理治療不穩定型心絞痛，尤其是急性心肌梗死超早期應用提供了實驗依據。

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張嚴高(1964-)，男，漢族，主任醫師，主要從事老年心血管疾病及療養保健工作

參考文獻

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Effects of Dexamethasone on Acute Myocardial Injury induced by Isoproterenol and T Cells in Spleen

ZHANG Yan-gao1， YU Lei2, WANG Jian-li2, ZU Min-xiang3，*,YIN Dai-jia-jia1

1The First Department of Sanatorium, Hangzhou Sanatorium of Nangjing Military Area Command, Hangzhou 310007,China；2Institute of Immunology,Medicine School of Zhejiang University, Hangzhou 310058,China；3Department of Neurosurgery, 117 Hospital of PLA,Hangzhou 310013,China；*Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate potential protective effect of glucocorticoid receptor(GR)agonist dexamethasone(DEX) on isoproterenol(ISO)-induced myocardial injury and the possible mechanism．Method: The sixteen mice were randomly divided into control(CON) group(n=4)，ISO group(n=4), dexamethasone pretreatment(DEX+ISO) group (n=4)and dexamethasone treatment(ISO+DEX) group(n=4).ISO group, DEX+ISO group and ISO+DEX group received 5mg/kg isoproterenol hydrochloride, daily intraperitoneal injection of 1 time, continuous 3 days.DEX+ISO group given dexamethasone(1.25mg/kg)injection by intraperitoneal injection as a pretreatment before treatment 30 minutes. At the 2nd and 3rd day, dexamethasone(1.25mg/kg) was given after ISO injected 30 minutes in ISO+DEX group. The serum AST, LDH, CK, and CK-MB were detected. Myocardial tissue injury was assessed by HE staining.Flowcytometry was adopted to detect the expression of T cell subpopulation.Results: ①Compared with control group，the levels of AST,LDH and CK were significantly increased；the degree of myocardial injury were greatly deteriorated in ISO group(P<0.01);the expression 0f CD8+T cells and CD4+CD69+T cells were greatly increased(P<0.05,P<0.01).②Compared with ISO group ,the levels of AST and CK was significantly reduced(P<0.01);the levels of LDH and CK-MB were reduced(P<0.05);the degree of myocardial injury was greatly improved(P<0.01) in DEX+ISO group; the expression of CD4+T cells and CD8+T cells were significantly reduced(P<0.01),the expression of CD4+CD69+T cells were significantly increased(P<0.01) in DEX+ISO group.③Compared with ISO group ,the expression of CD8+T cells were reduced(P<0.05) and the other wasn't difference (P>0.05) in ISO+DEX group.Conclusion: DEX pretreatment has protective effect against ISO-induced myocardial injury. The mechanism might be the transformation of immune function．

【Key words】Dexamethasone;Isoproterenol;Myocardial injury; CD4+;CD8+;CD69+;Mice Debonera等[1]發現糖皮質激素對肝臟缺血-再灌注損傷具有保護作用，并首次證實地塞米松(Dexamethasone,DEX)通過抑制炎癥信號通路減輕實質性臟器缺血-再灌注損傷，為臨床提供了新的選擇和理論支持。目前研究提示抑制炎癥反應可減輕急性心肌缺血損傷，以及DEX預處理對心臟、腎臟缺血-再灌注損傷有早期保護和延遲保護作用[2，3]。但DEX預處理或治療對急性心肌缺血損傷的影響機制研究較少。本文觀察DEX預處理和后處理對異丙腎上腺素(Isoprotereno，ISO)致急性心肌缺血損傷小鼠心肌酶學指標、心肌組織結構和脾臟免疫T細胞的影響，為臨床應用的可行性提供實驗室依據。

[中圖分類號]R542.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2016)02-0009-05

第一作者簡介：本文

本文2015-12-10收到，2016-01-26修回