缺氧誘導因子-1α在子宮內膜異位癥患者子宮內膜的表達及意義

代滿榮　洛若愚

luruoyu1018@126.com

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缺氧誘導因子-1α在子宮內膜異位癥患者子宮內膜的表達及意義

代滿榮1,2洛若愚1，*

luruoyu1018@126.com

【摘要】目的：觀察分析缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)在子宮內膜異位癥(簡稱內異癥)患者子宮內膜細胞的表達及意義。方法：收集不同r-AFS分期子宮內異癥患者(內異癥組，n=35)和同期子宮肌瘤患者(對照組，n=40)子宮內膜組織標本，應用免疫組織化學(SP)技術檢測各組(期)HIF-1α的表達情況，分析組間差異及與r-AFS分期的相關性。結果：子宮內異癥組異位、在位子宮內膜HIF-1α陽性表達率分別為82.86%和77.14%，均明顯高于對照組子宮內膜(52.50%)(χ2=7.741、4.920,P均<0.05)，且子宮內異癥組子宮內膜HIF-1α陽性表達率隨r-AFS分期提高而升高(r= 0.363，P<0.05)。結論：HIF-1α表達上調可能與子宮內異癥的發生發展有關。

【關鍵詞】子宮內膜異位癥； 缺氧誘導因子-1α

子宮內膜異位癥(簡稱內異癥)是婦科常見病、多發病，是導致生育期婦女慢性腹腔痛、不孕的常見原因之一，約有8%-10%的生育期婦女患有此病[1]。子宮內異癥的病因及發生機制目前仍不明確，研究[2]提示，血管生成在子宮內異癥形成和發展中具有重要作用，但是子宮內膜異位病灶如何獲得血管生成能力目前還不清楚。缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1α)是機體缺氧狀態的關鍵調節轉錄因子，通過促進血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、血管生成素(Angiogenin，Ang)、血小板生長因子(Platelet Growth Factor，PGF)等的表達，對異位子宮內膜的血管生成發揮重要作用[3，4]。本文采用免疫組織化學技術檢測不同程度子宮內異癥患者異位子宮內膜、在位子宮內膜HIF-1α的表達情況，并分析其臨床意義。

1資料與方法

1.1病例和分組

2012-10—2013-12在本院行子宮內異癥手術治療患者(內異癥組，n=35)，根據病檢結果并參照美國生育學會內異癥分期標準(Revised Classification of American Fertility Society，r-AFS)[5]分為Ⅰ期(n=2)、Ⅱ期(n=8)、Ⅲ期(n=16)、Ⅳ期(n=9)。另選同期子宮肌瘤全切術患者作為對照組(n=40)。納入標準：(1)內異癥組均為原發性子宮內異癥患者，經病理檢查確診；對照組既往均無子宮內異癥或其它子宮內膜疾病。(2)兩組患者均無內分泌疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤及嚴重肝、腎疾病；(3)兩組患者術前3個月未使用激素類藥物。兩組患者年齡、初潮年齡、月經期別、人工流產次數、分娩次數等一般情況差異無統計學意義(t值0.6-1.1，P>0.05)，見表1。收集標本前，所有患者均知情同意。

表1　兩組一般情況比較±s)

1.2標本采集和制片

快速切取同一子宮內異癥患者異位和在位子宮內膜以及對照者正常子宮內膜組織，大小約1cm×1cm×1cm，立即用生理鹽水輕輕清洗表面血漬，10%福爾馬林固定24h后常規方法脫水、包埋、切片(厚約4μm)。

1.3免疫組化染色

1.3.1主要試劑：兔抗人HIF-1α多克隆抗體購自武漢谷歌生物工程有限公司(貨號：BA1231-3), DAB顯色試劑盒購自美國Sigma公司(貨號：1262159)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自碧云天公司,中性樹膠購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3.2免疫組化染色方法：依照SP 試劑盒說明書，先置切片于65℃烘箱中烘片2h，再常規脫蠟至水化，微波加熱90s修復抗原，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉20min，一抗濕盒4℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；同時以PBS代替一抗作陰性對照，顯微鏡觀察結果。

1.3.3結果判定：SP染色子宮內膜細胞胞漿呈淡棕色為弱陽性，棕色為陽性，棕褐色為強陽性[6]。光學顯微鏡下每張切片隨機選擇10個高倍視野，結合染色強度和陽性細胞數量取均值作為1例標本結果納入各組進行比較分析。觀察結果分為4級：(1)陽性細胞數<1%，且染色強度弱陽性為HIF-1α表達陰性；(2)陽性細胞數1%-10%，且>50%細胞染色強度弱陽性為HIF-1α表達弱陽性(+)；(3)陽性細胞數10%-60%，且>50%細胞染色強度弱陽性至強陽性為HIF-1α表達陽性(++) ；(4)陽性細胞數>60%，且50%以上細胞染色強度陽性至強陽性為HIF-1α表達強陽性(+++)。每組HIF-1α 陽性表達率的計算方法為每組(每期)SP結果(+)-(+++) 的細胞數占該組(期)標本總細胞數的百分比。

1.4統計學處理

2結果

2.1各組HIF-1α表達陽性率

HIF-1α在對照組和內異癥組子宮內膜均有表達，內異癥組異位患者強陽性表達，主要見于胞漿內，呈棕褐色、彌漫性或灶狀分布(圖1A)，內異癥組在位患者為陽性表達，呈棕色、彌漫性分布(圖1B)；對照組子宮內膜為弱陽性表達，呈淡棕色、散在分布(圖1C)。定量分析其陽性表達率，內異癥組異位內膜與在位內膜HIF-1α陽性率分別為82.86%和77.14%，均顯著高于對照組(χ2=7.741,P<0.01；χ2=4.920,P<0.05)，異位內膜和在位內膜HIF-1α陽性表達率差異無統計學意義(χ2=0.357,P>0.05)。見表2。

2.2內異癥患者HIF-1α表達與r-AFS分期的關系

內異癥Ⅰ期—Ⅳ期，HIF-1α表達率從50.00%升高到88.89%，明顯表現為隨r-AFS分期提高，HIF-1α表達逐漸增強。兩變量呈顯著正相關(r=0.363，P<0.05)。見表3。

表2　內異癥組和對照組HIF -1α陽性表達率比較

注：與對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

表3　r-AFS不同分期內異癥患者HIF -1α表達陽性率

[本文圖1-圖3見封3]

3討論

子宮內異癥指具有生長能力的子宮內膜腺體和間質在子宮腔以外部位生長引起的，以繼發性進行性痛經、慢性盆腔痛和不孕為主要臨床表現的激素依賴性婦科疾病，其發病機制仍不完全清楚。在較多機制學說如種植學說、體腔上皮化生學說、誘導學說、免疫學說中，目前更多傾向于種植學說，即子宮內膜組織隨逆流的經血通過輸卵管進入盆腔及腹腔, 在局部細胞及細胞因子的參與下，逃避免疫清除并存活，繼而黏附、侵襲局部組織，形成異位病灶。HIF在此過程中扮演重要角色。

HIF-1是由HIF-1α和 HIF-β兩個亞基組成的異源二聚體[7]，其中HIF-1α既是活性亞基又是調節亞基，在機體缺氧情況下，通過與低氧反應元件(Hypoxia Response Element，HRE)結合，調節下游靶基因的轉錄過程，涉及細胞凋亡、增殖、血管生成、能量代謝及紅細胞生成等諸多方面[8]。大量研究[9-12]表明HIF-1α在腫瘤的血管生成、侵襲和轉移等多種病理過程中發揮重要作用。子宮內異癥雖屬良性疾病，但其增殖、浸潤、轉移及復發等病理行為類似惡性腫瘤，HIF-1α在子宮內異癥中的作用也受到廣泛關注。張曉梅等[13]報道50例子宮內異癥患者在位、異位子宮內膜VEGF及CD31的表達顯著高于正常子宮內膜。Lu等[14]觀察到不同濃度氧預處理的內異癥在位子宮內膜移植到SCID小鼠，即重癥聯合免疫缺陷綜合癥( Severe Combined Immune Deficient Disease)小鼠后，發現低氧預處理能促進子宮內膜異位灶的增殖和血管生成相關標志物如細胞增殖抗原標記物(Ki67)、血小板內皮細胞黏附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1,PECAM-1,又稱CD31)、VEGF、HIF-1α表達上調，而高氧預處理則有抑制作用。Critchley等[15]研究發現HIF-1α在正常子宮內膜的表達量在分泌晚期和月經期最大。 Goteri等[16]在子宮內異癥患者異位灶局部檢測到HIF-1α表達量顯著高于正常子宮內膜組織。這些結果均表明內異癥的發生發展與促血管因子表達上調和血管生成有關，HIF-1α可能在其中起到促進作用。

本文樣本的對照組子宮內膜、在位及異位子宮內膜均被檢測到HIF-1α蛋白的表達，且異位內膜及在位內膜的HIF-1α表達顯著高于對照組內膜，與上述報道相一致。內異癥患者在位內膜組織中增高的HIF-1α可能一方面通過其促增殖和抗凋亡作用[17]增加脫落內膜組織在異常部位的存活能力；另一方面上調VEGF的表達[18]而為其在異常部位種植生長提供血管支持。進一步分析內異癥不同r-AFS分期患者異位灶局部HIF-1α的表達結果發現，隨著r-AFS分期的提高，HIF-1α的表達逐漸增強，兩者呈顯著正相關。提示HIF-1α不僅參與子宮內異癥的發生，可能還促進其進展，如進一步加重局部纖維化和異位灶內缺氧，進一步加重局部炎癥，使非低氧誘導的HIF-1α增加；增加的HIF-1α又進一步促進異位內膜組織的增殖、侵襲能力，使內異癥病變不斷發展和惡化。

總之，HIF-1α表達增加可能是子宮內異癥發生發展的重要機制之一，理論上或可作為子宮內異癥治療新靶點，但臨床可行性有待進一步論證。

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代滿榮(1975-)，女，漢族，碩士研究生，副主任醫師，主要從事婦產科臨床工作

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The Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α in the Endometrium of Patients with Endometriosis

DAI Man-rong1,2LUO Ruo-yu1，*

1Department of Gynecology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060, China;2Department of Obstetrics and Gynecology, Xiantao People’s Hospital , Xiantao 433000, China;*Corresponding authors

【Abstract】Objective: To study the expression of hypoxia inducible factor-1α protein in the endometrium of patients with endometriosis.Method: The specimens were gathered from endometrium of 35 patients with endometriosis and 40 cases with hysteromyoma as control group. 35 cases with the endometriosis were staged according to the revised American Fertility Society System. Immunohistochemistry SP method was performed to examine the expression of hypoxia inducible factor-1α protein in the endometrium and the results were analyzed statistically.Results: The positive rates of hypoxia-inducible factor-1α protein in ectopic and eutopic endometria tissue were 82.86% and 77.14% respectively, which were significantly higher than that in control group (52.50%). There were statistical differences between the expression of hypoxia-inducible factor-1α protein in ectopic and eutopic endometria tissue and that in control group (χ2=7.741, χ2=4.920,P<0.05). The expression of hypoxia-inducible factor-1α protein was significantly positively correlated with r-AFS stage (r=0.363，P<0.05).Conclusion: The up-regulation of hypoxia-inducible factor-1α protein expression was possibly relevant to the development of the endometriosis.

【Key words】Endometriosis；Hypoxia inducible factor-1α

[中圖分類號]R711.71

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2016)02-0014-04

第一作者簡介：本文

本文2015-12-16收到，2016-02-19修回