精子形態可否預測精子其他參數和受精結局

戢開麗 郭江華 梁輝洪 關藝青 婁 娟江門市中心醫院生殖醫學中心（廣東江門 529030）

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精子形態可否預測精子其他參數和受精結局

戢開麗 郭江華 梁輝洪 關藝青 婁 娟
江門市中心醫院生殖醫學中心（廣東江門 529030）

摘要目的 探討精子形態在輔助生殖治療中對選擇授精方法時有否預測價值和意義。方法 回顧性分析2012年6月至2015年2月接受輔助生殖治療的1 951周期患者精液資料，根據《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第五版）精子正常形態率參考值下限為4%，將患者的精子正常形態率分成3組：A組＜1.0% 470周期，B組1%～4% 562周期，C組≥4% 919周期，分別采用常規體外受精（IVF）或卵胞漿內單精子注射（ICSI）以及IVF受精失敗后補救ICSI（RICSI）授精方式，比較3組精子正常形態與其他精液參數相關性，與授精方式、受精率、優質胚胎率的關系。結果 除了頂體酶外，精子濃度、活力、前向運動率、DNA完整率在3組形態間都差異極顯著（P＜0.01），而且它們與精子正常形態呈顯著的正相關；授精方式上3組的IVF比例分別是72.3%、86.7%、96.8%，ICSI組27.7%、13.3%、3.2%，3組間授精方式差異極顯著（P＜0.01），RICSI比例也隨著精子正常形態率升高而降低；受精結局上，只有IVF組3組形態間受精率（67.0%、70.0%和79.6%）差異極顯著（P＜0.01），且和精子正常形態率趨勢一致；胚胎質量反映在不同授精方式上趨勢各有不同。結論 精子正常形態與其他大部分的精液參數有正相關性，影響IVF的受精率，故在輔助生殖治療中對授精方式選擇有一定指導意義。

關鍵詞受精,體外;精子形態;DNA完整率;受精率

Key woorrddss Fertilization In Vitro;sperm morphology;DNA integrity;fertilization rate

近年來受環境和社會壓力等影響男性的生殖健康呈下降趨勢，據統計全球約有10%～15%的不孕不育夫婦，其中近一半是男性因素導致不育，需要尋求輔助生殖技術幫助。在輔助生殖治療的過程中，精子與卵子結合是一個復雜的過程，影響因素很多，其中精子形態對受精率的影響一直存在著爭議。2010年《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）》[1]（以下簡稱WHO第五版）將精子正常形態率的參考值下限從第四版的15%下調至4%，這個重大的變化讓我們重新審視精子正常形態對生育力的預測。精子正常形態率低是否影響體外受精（In vitro fertilization，IVF）受精率呢？是否需要把精子正常形態作為卵胞漿內單精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）的指征？目前有關精子形態相關的報道[2-7]大部分是遵循WHO第四版手冊的分類標準。本文根據WHO第五版精子正常形態率4%的參考值下限，將精子正常形態率分為3組：＜1.0%， 1%～4%和≥4%，以探索精子形態是否可預測精子功能和輔助生殖技術（ART）治療的受精結局。

材料與方法

一、對象與分組

選擇江門市中心醫院生殖中心2012年6月至2015 年2月接受ART治療1951周期，其中IVF治療的夫婦1 717 周期，ICSI治療的夫婦234周期，入選條件女方≤35歲，并排除全卵不熟和透明帶異常的周期。女方平均年齡（30.3±3.1）歲，男方平均年齡（32.9±4.1）歲。平均不育年限（4.1±2.7）年，其中原發不孕1173周期，繼發不孕778周期。按患者的精子正常形態率分成3組：A組 ＜1.0% 470周期，B組1%～4% 562周期，C組≥4% 919周期，分別采用常規IVF或ICSI授精方式。

二、方法

（一）促排卵方案

促排卵采用長方案、短方案、拮抗劑方案等，卵泡發育成熟后，注射HCG 5 000～ 10 000IU，于35～36h在超聲引導下經陰道穿刺取卵。

（二）精液分析及處理

禁欲3～7d，手淫法獲取精液，按照WHO第五版操作程序，對原始精液標本進行精子的濃度、活率、頂體酶、DNA完整率等常規檢查和改良巴氏染色法精子形態學檢查。正常形態的精子是頭部光滑呈橢圓形，頂體占40%～70%；中段細長規則，長度與頭部相等；主段比中段細，長約45μm[1]。精子正常形態率≥4%為形態正常的精子，2%～4%為輕度畸形精子，1～2%為中度畸形精子，＜1%重度畸形精子。

取卵日，精子濃度≤1×106/mL或活力＜10%行ICSI，否則行IVF授精。精液采用密度梯度離心+上游法處理，調整精子濃度為1×106/mL進行IVF授精。若處理后濃度低于0.2×106/mL，則改行ICSI。

（三）體外受精與胚胎移植

常規IVF：取卵后2～4h將卵冠丘復合體加入含精子的100μL受精滴中，3～4h后去除顆粒細胞，觀察卵子的第二極體排出情況以確定是否受精，如果疑似雙極體（2pb）≤25%，則行補救ICSI（Rescue ICSI，RICSI）。然后轉移到卵裂期胚胎培養液中，置于6%CO2、37℃培養箱培養，試劑采用Quinn’s Advantage序貫培養基（SAGE，美國）。

ICSI：取卵后4～5h將卵冠丘復合體放在80IU/mL透明質酸酶（SAGE，美國）消化30～60s，然后用拆卵針去除顆粒細胞，在顯微操作儀中行ICSI操作。

授精后16～18h觀察原核，見雙原核（2PN）為正常受精，第二天、第三天觀察胚胎發育，根據發育速度、卵裂球大小均勻及碎片等情況評估胚胎質量。第三天胚胎細胞數在6～9個，碎片≤25%且均一或相對均勻的為優質胚胎。選擇第三天細胞數多且碎片少的胚胎進行移植。

三、統計學方法

用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析、x2檢驗和相關性分析，P＜0.05表示差異具統計學意義。

結 果

一、我院精子正常形態率百分位數分布

從表1中可見，我院患者群體的精子正常形態率檢查結果低于WHO第五版的調查數據。

表1　 我院精子正常形態率百分位數與WWHHOO第五版比較

二、3組患者的基本情況比較

對A組、B組、C組的女方年齡、男方年齡、不孕年限、基礎FSH值、基礎竇卵泡數和獲卵數等基本情況進行比較，3組間均無顯著差異（P＞0.05）（表2）。

表2　 3組患者的基本情況比較

三、3組患者的精液常規比較和相關性分析

A組、B組、C組3組形態的精液常規比較， 各組間濃度、活力、前向運動率、頂體酶、DNA完整率均差異顯著（P＜0.01）；而且除了頂體酶外，隨著精子正常形態率的升高，其他精液參數都呈上升趨勢。精子正常形態與其他精液參數的相關性分析也發現，除了頂體酶外，都呈現正相關，（表3）。

四、3組患者的授精方式比較

3組間IVF和ICSI的授精方式差異顯著（P＜0.01），隨著精子正常形態率的升高，ICSI比例逐漸降低，A 組ICSI比例27.7%最高，C組極少部分行ICSI，只有3.2%。RICSI授精方式中，其比例也隨著正常形態率升高而降低，（表4）。

表3　 3組形態患者的精液常規比較和相關性分析

表4　 3組患者的授精方式比較

五、3組形態患者受精結局和胚胎質量比較

在IVF組中，3組間受精率差異極顯著（P＜0.01），隨著精子正常形態率的升高，受精率也逐漸提高，卵裂率差異不顯著，優質胚胎率差異極顯著（P＜0.01），但其趨勢與精子正常形態相反。在ICSI組中，3組間受精率差異顯著（P＜0.05），但受精率與精子正常形態率的趨勢不一致，卵裂率和優質胚胎率都差異不顯著（P＞0.05）。在RICSI組中，3組間的受精率和優質胚胎率都差異不顯著（P＞0.05），（表5）。

表5　 3組患者受精結局和胚胎質量比較

討 論

受精過程中精卵結合是一個復雜的過程，包括卵母細胞成熟、精子成熟、精子獲能、精子穿過透明帶、配子融合、卵子激活等等，任何一個環節出錯都可能導致受精失敗。在許多受精失敗的案例里，有時我們很難判定是卵子還是精子的原因。Ombelet等[8]認為精子形態對精卵結合很重要，但一旦精子到達卵胞質就失去預測的價值了，他還建議精確和嚴格的精子形態檢查對受精潛能是有預測價值的。這符合WHO第五版對精子形態正常率的修訂。但迄今為止，精子形態的預測作用仍存在爭議，許多研究[2-4,9-11]表明精子形態是影響IVF結局的一個重要指標，而有些研究[7,12-13]又認為精子形態既不影響受精率也不影響妊娠結局。

本研究結果顯示精子形態影響其他大部分精液常規的參數，如精子濃度、活力、前向運動率、DNA完整率等，精子正常形態率與它們都呈顯著的正相關。Gandini 等[14]也認為形態缺陷伴有DNA碎片的增加。正因為如此，3組精子形態的ICSI比例、RICSI比例也隨著精子正常形態率升高而逐漸下降。IVF組中，3組間受精率差異顯著（P＜0.01），并且隨著精子正常形態率的升高而上升，說明精子形態一定程度上影響IVF的受精（其結果與大部分報道[2-5,11]一致）。而在ICSI組中，3組間受精率雖然差異顯著（P＜0.05），但與精子正常形態率的趨勢不一致，這可能是3組間ICSI的樣本量差異有關，在C組中，ICSI比例只有3.2%（29周期），而A組ICSI比例是27.7%（130周期）。另外Li等[11]認為胚胎學家在顯微鏡下盡可能選擇看起來形態正常的精子進行ICSI操作，故受精的精子不能代表精子樣本總體形態情況，也可能是ICSI受精率與精子正常形態率不是一個規律性的變化。

與精子形態對IVF沒有預測作用的報道比較發現，第一個原因，可能跟IVF和ICSI的比例不同有關，有些國家使用ICSI不到總周期的30%，有些超過50%甚至高達到90%以上，如美國2013年ICSI比例是67%[15]，英國是52.6%[16]。ICSI比例的加大，IVF受精率受精子形態影響就弱化了。本文ICSI和RICSI的總比例是23.6%，不到30%。第二個原因，可能精子形態分組不一樣，王晟等[7]把精子正常形態率分為5%～10%、10%～15%和≥15% 3組，甚至沒有≤5%的數據，故得出的結論是當正常形態精子百分率＞5%時，精子形態對常規IVF的治療結局沒有影響。本文按照WHO第五版的標準和趨勢，把精子形態分組細化，分節點為1%、4%，在極低的精子正常形態率中，對IVF受精的影響就凸顯出來了。

胚胎質量上無論IVF組還是ICSI組，優質胚胎率趨勢與精子正常形態率不相同，說明精子形態可能不影響胚胎質量。但是即使本研究顯示精子形態對IVF受精率有影響，但是在A組（＜1%）中受精率是67.0%，仍然較衛生部規定的65%高[17]。故建議，精子形態在指導授精方式選擇的時候，還要結合精液常規的其他參數，如DNA完整性，以及精子染色質凝聚性、精子凋亡等等。

另外，高洋等[2]提出雖然精子形態可以預測IVF受精率，但受實驗條件、技術人員主觀差異的影響，各生殖中心應建立自己的正常形態cut-off值作為常規IVF選擇。與WHO第五版比較，本中心精子正常形態率的百分位數分布顯示，整體精子正常形態率低很多，WHO第五版第50個百分位是15.0%，我們是3.86%，這都提示在精子正常形態的診斷中技術人員主觀性可能起了非常大的影響。印度為了降低技術人員的主觀差異專門組織174名實驗工作人員進行精子形態培訓[18]，這是非常必要的。此外，精子形態檢查還具有多態性，Nikolettos等[19]指出用光學顯微鏡行精子檢查只能提供有限的信息，精子的超微結構更能說明形態對精子的影響。因此，胞質內形態學選擇精子注射（IMSI）和活動精子細胞器形態學檢查（MSOME）技術的應運而生，希望能改善ICSI的臨床結局。

總之，精子形態一定程度上預示著精子的功能，影響輔助生殖治療中IVF的受精結局。但在選擇IVF還是ICSI的授精方式時，最好結合其他精液常規，如精子濃度、活力和DNA完整率等，防止IVF完全不受精或ICSI的過度使用。

參考文獻

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13 Van den Hoven L,Hendriks JC,Verbeet JG,et al.Status of sperm morphology assessment:an evaluation of methodology and clinical value.Fertil Steril 2015;103(1):53-58

14 Gandini L,Lombardo F,Paoli D,et al.study of apoptotic DNA fragmentationg in human spermatozoa.Hum Reprod 2001;15(4):830-839

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17 中華人民共和國衛生部.人類輔助生殖技術規范.衛科教發[2003]176號文件,2003.6.27

18 Franken DR,Joshi C.Sperm morphology training in India.Andrologia 2015;47(8):932-934

19 Nikolettos N,Küpker W,Demirel C,et al.Fertilization potential of spermatozoa with abnormal morphology.Hum Reprod 1999;14 Suppl 1:47-70

（2015-06-15收稿）

·臨床經驗·

Effects of sperm morphology on sperm function and fertilization outcomes

Ji Kaili,Guo Jianghua,Liang Huihong,Guan Yiqing,Lou Juan
Center for Assisted Reproduction,Jiangmen Central Hospital,Jiangmen 529030,Guangdong,China

AbstractObjectivee To investigate the infl uence of sperm morphology on sperm function and fertilization outcomes of in vitro fertilization (IVF),and explore its prediction value in choosing treatment methods on assisted reproductive technology(ART).Metthhooddss This study retrospectively analyzed 1951 cycles of infertile couples treated with conventional IVF,ICSI or rescue ICSI(RICSI) from June 2012 to February 2015,and according to 4% as the lower reference limits of sperm normal morphology provided by WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen (5th Edition),the cycles were divided into three groups:470 cycles with values<1.0% in A group;562 cycles with values ≥1.0% and <4% in B group;and 919 cycles with values ≥4.0% in C group.Ressuullttss There were extremely signifi cant differences in sperm concentration,total motility,progressive motility and DNA integrity among three groups (P<0.01),but no signifi cant difference in acrosin activity.There were positive correlations between sperm normal morphology and other parameters.Meanwhile,the percentage of IVF was 72.3%,86.7% and 96.8%,and the percentage of ICSI was 27.7%,13.3% and 3.2%,respectively,there were statistically signifi cant differences in treatment methods (P<0.01).the percentage of RICSI decreased by sperm normal morphology.Fertilization rate (67.0%,70.0% and 79.6%) had extremely signifi cant difference only in conventional IVF group(P<0.01),and with the increase in sperm normal morphology,fertilization rate increased;there was no consistent trend in embryo quality among different insemination ways.Concluussiioonn There is positive correlation between sperm normal morphology and most semen parameters,and sperm morphology infl uences IVF fertilization rate,which is some valuable indicatior to select IVF or ICSI on ART treatment.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.09

中圖分類號R 321-33