血清及卵泡液中25-羥維生素D水平與IVF-ET早期妊娠結(jié)局的關(guān)系

馬娟，何玉潔，許冰雪，閻夢民，范晶，劉師偉，王媛

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原　030001；2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，太原　030001)

血清及卵泡液中25-羥維生素D水平與IVF-ET早期妊娠結(jié)局的關(guān)系

馬娟1，何玉潔2*，許冰雪1，閻夢民2，范晶2，劉師偉2，王媛1

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原030001；2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，太原030001)

【摘要】目的探討血清及卵泡液中25-羥維生素D[25(OH)D]水平與IVF-ET助孕治療早期妊娠結(jié)局的關(guān)系。方法選取2014年9月至2015年5月在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心就診，因輸卵管因素不孕行IVF-ET助孕治療的患者，共123例，測定血清及卵泡液中25(OH)D水平，根據(jù)血清及卵泡液25(OH)D水平分為<25 nmol/L組、25～50 nmol/L組和>50 nmol/L組，比較各組間的胚胎種植率、臨床妊娠率和早期流產(chǎn)率有無差異。又按照妊娠結(jié)局分為妊娠組和未妊娠組，比較兩組間血清及卵泡液25(OH)D水平有無差異。結(jié)果血清25(OH)D水平與卵泡液中25(OH)D水平呈顯著正相關(guān)(r=0.811，P<0.001)；血清不同25(OH)D水平各組中，>50 nmol/L組的胚胎種植率(53.3%)及臨床妊娠率(73.3%)均顯著高于<25 nmol/L組(27.5%和28.0%)(P<0.05)。卵泡液不同25(OH)D水平各組中，25～50 nmol/L組及>50 nmol/L組的胚胎種植率(分別為42.3%、70.0%)及臨床妊娠率(分別為66.7%、80.0%)均顯著高于<25 nmol/L組(胚胎種植率為21.4%、臨床種植率為28.6%)(P均<0.05)。各組間的早期流產(chǎn)率比較無顯著性差異(P>0.05)。妊娠組血清及卵泡液25(OH)D水平[分別為(38.41±13.58)nmol/L、(32.03±13.35)nmol/L]均顯著高于未妊娠組[分別為(29.68±12.23)nmol/L、(23.41±11.54)nmol/L](P<0.05)。結(jié)論不孕癥患者普遍存在維生素D缺乏，IVF-ET患者的妊娠率下降可能與維生素D缺乏有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】體外受精-胚胎移植；妊娠；25-羥維生素D

Objective： To explore the association of 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] levels in serum or follicular fluid with early pregnancy outcomes of IVF-ET.

Methods： One hundred and twenty three infertile women with tubal factor participated in IVF-ET cycles in the reproductive center of The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University from September 2014 to May 2015. The 25(OH)D levels in serum or follicular fluid were detected by electrochemical luminescence. The patients were divided into three groups：<25 nmol/L，25-50 nmol/L，and>50 nmol/L group. Clinical pregnancy rate，embryo implantation rate and early abortion rate were compared among three groups. Furthermore，the patients were divided into pregnancy group and no-pregnancy group，and the 25(OH)D levels in serum or follicular fluid were compared among the groups.

Results： The levels of 25(OH)D in serum were significantly correlated with that in follicular fluid (r=0.811，P<0.001). Among the three groups with different 25(OH)D levels in serum，the implantation rate (53.3% vs. 27.5%) and pregnancy rate (73.3% vs. 28.0%) in >50 nmol/L group were significantly higher than these in <25 nmol/L group (P<0.05). Among the three groups with different 25(OH)D levels in follicular fluid，the implantation rate (42.3%，70.0%) and pregnancy rate (66.7%，80.0%) in 25-50 nmol/L group and >50 nmol/L group were significantly higher than these in <25 nmol/L group (21.4% and 28.6%，respectively) (P<0.05). There were no significant differences in the early abortion rate among the three groups (P>0.05). The 25(OH)D levels in serum [(38.41±13.58) vs. (29.68±12.23) nmol/L] or follicular fluid in pregnancy group [(32.03±13.35) vs. (23.41±11.54) nmol/L] were significantly higher than those in no-pregnancy group (P<0.05).

Conclusions： Vitamin D deficiency is common in infertile patients. The lack of 25(OH)D may be associated with lower pregnancy rate of IVF-ET patients.

Key words： IVF-ET；Pregnancy；25-hyroxy vitamin D

(J Reprod Med 2016，25(5)：411-416)

維生素D除參與鈣磷代謝、維持骨骼穩(wěn)態(tài)外，還具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)、抗炎、緩解胰島素抵抗等作用，與心血管疾病、慢性腎臟病、腫瘤等的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。有研究表明，維生素D可調(diào)節(jié)人類的生殖過程[3]，還與多種婦科疾病的發(fā)生有關(guān)[4]，維生素D缺乏可導(dǎo)致女性生殖內(nèi)分泌的紊亂，甚至不孕[3-5]。本研究旨在通過測定血清及卵泡液中25-羥維生素D[25(OH)D]水平，分析兩者的相關(guān)性，并初步探討其與IVF-ET妊娠結(jié)局的關(guān)系。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2014年9月至2015年5月在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET助孕治療的不孕癥患者(123例)的臨床資料，年齡20～40歲，不孕原因為單純輸卵管因素。所有對象均排除其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及內(nèi)科疾病，無子宮畸形及宮頸疾病，無肝腎功能異常。治療前各項化驗指標正常，基礎(chǔ)FSH水平<0.01 U/L。所有患者均簽署了知情同意書。記錄研究對象的基本資料，包括年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限等。

二、研究方法

1. IVF-ET：所有患者均采用口服媽富隆處理后的黃體期長方案超促排卵方案。于IVF-ET治療前1周期給予口服媽富隆(歐加農(nóng)，荷蘭)每日1片，口服媽富隆15 d后肌肉注射促性腺激素釋放激素(GnRH-a，達菲林，益普生，法國)1.8 mg。于月經(jīng)第2～4天達到垂體降調(diào)節(jié)后應(yīng)用FSH(果納芬，默克雪蘭諾，德國)促排卵，啟動劑量根據(jù)患者年齡、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)確定。所有患者均在1個優(yōu)勢卵泡直徑達18 mm或4個卵泡直徑達17 mm時，于當晚肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)6 000～10 000 U，36 h后在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，于取卵后第3天進行胚胎移植。所有患者均至少移植1個優(yōu)質(zhì)胚胎。從取卵日開始每日使用黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg肌肉注射行黃體支持。

胚胎質(zhì)量評價：根據(jù)《輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊臨床診療指南》[6]對卵裂期第3天(D3)胚胎進行評分，由實驗室固定一人操作，采用五級評分法：1級：≥8細胞，碎片<10%，良好的細胞間接觸，無多核卵裂球；2級：≥8細胞，碎片占10%～20%，或缺乏良好的細胞間接觸，無多核卵裂球；3級：6～7細胞或8細胞，碎片約占20%，或卵裂球大小不均，無多核卵裂球；4級：>8細胞或4～6細胞，或8細胞，但碎片>20%，或卵裂球小不均或有多核卵裂球；5級：<4細胞或大量碎片，或半數(shù)卵裂球為多核。1級和2級為優(yōu)質(zhì)胚胎，1、2、3級為可移植胚胎。

2. 25(OH)D水平測定：由檢驗科工作人員采用電化學(xué)發(fā)光法測定25(OH)D水平。所有患者于口服媽富隆前空腹抽取靜脈血測定血清中25(OH)D水平；于取卵日在陰道超聲引導(dǎo)下，吸取直徑>17 mm的卵泡，留取第二管清亮混合卵泡液，剔除含有沖洗液及血液污染的卵泡液，回收卵母細胞后測定成熟卵泡中卵泡液25(OH)D水平。

3. 實驗分組：目前對于25(OH)D水平的劃分標準還存在爭議，比較認同的劃分標準為：嚴重缺乏(<25 nmol/L)、缺乏(25～50 nmol/L)、不足(51～75 nmol/L)、充足(>75 nmol/L)[7]。因此，根據(jù)患者血清及卵泡液中25(OH)D水平，將研究對象分為<25 nmol/L組、25～50 nmol/L組、>50 nmol/L組，比較各組間的胚胎種植率、臨床妊娠率及早期流產(chǎn)率有無差異。又按照妊娠結(jié)局分為妊娠組和未妊娠組，比較兩組間血清及卵泡液25(OH)D水平有無差異。

4. 觀察指標：詳細記錄患者的獲卵數(shù)、胚胎數(shù)、受精數(shù)、MⅡ卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、妊娠結(jié)局等。移植后14 d測定血HCG>25 U/L者繼續(xù)予黃體酮肌肉注射；移植后4周，B超檢查宮腔內(nèi)見妊娠囊及原始心管搏動者確定為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、血清、卵泡液25(OH)D水平相關(guān)性分析

血清25(OH)D水平與卵泡液25(OH)D水平呈顯著正相關(guān)(r=0.811，P<0.001)(圖1)。

二、血清、卵泡液中不同25(OH)D水平的患者一般資料比較

本研究共收集123例IVF-ET患者，其中有37例因孕酮高、子宮內(nèi)膜薄或患者個人原因取消移植，未納入分析。納入分析的86例移植患者中，各組間一般資料比較，均無顯著性差異(P>0.05)(表1、2)。

圖1　血清25(OH)D水平與卵泡液25(OH)D水平的相關(guān)性

組 別例數(shù)年齡(歲)不孕年限(年)BMI(kg/m2)基礎(chǔ)FSH(U/L)<25nmol/L組2530.52±3.983.60±1.7323.53±4.030.07±0.0325～50nmol/L組4630.04±3.994.34±2.4422.73±3.070.07±0.03>50nmol/L組1530.46±3.995.07±3.9424.08±3.410.06±0.02

表2　卵泡液中不同25(OH)D 水平患者間基本資料比較(x-±s)

三、血清、卵泡液中不同25(OH)D水平的患者促排卵及胚胎移植情況比較

血清、卵泡液中不同25(OH)D水平的患者促排卵所用藥物劑量、獲卵數(shù)及形成胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、MⅡ卵數(shù)、受精數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、受精率、優(yōu)胚率等指標比較，均無顯著性差異(P>0.05)(表3、4)。

四、血清、卵泡液中不同25(OH)D水平的患者妊娠結(jié)局比較

血清中不同25(OH)D水平的患者妊娠結(jié)局比較，>50 nmol/L組的胚胎種植率和臨床妊娠率均顯著高于<25 nmol/L組(P<0.05)；早期流產(chǎn)率3組間比較，無顯著性差異(P>0.05)。卵泡液中不同25(OH)D水平的患者妊娠結(jié)局比較，25～50 nmol/L組及>50 nmol/L組的胚胎種植率和臨床妊娠率均顯著高于<25 nmol/L組(P均<0.05)；早期流產(chǎn)率3組間比較無顯著性差異(P>0.05)(表5、6)。

表3　血清中不同25(OH)D 水平患者促排卵及胚胎移植情況比較(x-±s)

表4　卵泡液中不同25(OH)D 水平患者促排卵及胚胎移植情況比較(x-±s)

表5　血清中不同25(OH)D水平患者妊娠結(jié)局比較 [n(%)]

注：與<25 nmol/L組比較，*P<0.05

表6　卵泡液中不同25(OH)D水平患者妊娠結(jié)局比較 [n(%)]

注：與<25 nmol/L組比較，*P<0.05

五、妊娠組與未妊娠組患者血清及卵泡液25(OH)D水平的比較

納入分析的86例移植患者中，42例妊娠(妊娠組)，44例未妊娠(未妊娠組)。妊娠組血清中25(OH)D的平均水平為(38.41±13.58)nmol/L，顯著高于未妊娠組的(29.68±12.23)nmol/L(P<0.05)；妊娠組卵泡液中25(OH)D的平均水平為(32.03±13.35)nmol/L，亦顯著高于未妊娠組的(23.41±11.54)nmol/L(P<0.05)。

討論

影響IVF-ET妊娠結(jié)局的因素眾多，目前認為胚胎質(zhì)量及子宮內(nèi)膜容受性是影響臨床妊娠率的主要因素。如何提高IVF-ET助孕治療的妊娠率始終是生殖領(lǐng)域醫(yī)生頗為關(guān)注的問題。已有研究證實，在卵巢、子宮內(nèi)膜、子宮基層等組織中均有維生素D受體的表達[8]。維生素D與其受體結(jié)合后，發(fā)揮多種功能，參與卵泡生成、刺激卵巢產(chǎn)生性激素以及子宮內(nèi)膜上相關(guān)基因的表達等[8-9]。

本研究通過對123例行IVF-ET助孕治療的患者資料進行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，所納入研究的患者中僅3例患者血清25(OH)D水平>75 nmol/L，且患者血清25(OH)D水平與卵泡液中25(OH)D水平呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，血清不同25(OH)D水平各組中，>50 nmol/L 組IVF-ET助孕的胚胎種植率和臨床妊娠率顯著高于<25 nmol/L組，卵泡液中25～50 nmol/L組及>50 nmol/L 組的胚胎種植率和臨床妊娠率均顯著高于<25 nmol/L組，且妊娠組血清及卵泡液中25(OH)D水平均顯著高于未妊娠組，3例25(OH)D水平正常的患者均成功妊娠，提示行IVF-ET助孕治療的患者其維生素D水平越高，早期妊娠結(jié)局可能越好。Ozkan等[10]對行IVF助孕治療的84例患者進行研究，經(jīng)過校正年齡、體重、移植胚胎數(shù)目等因素后，發(fā)現(xiàn)血清和卵泡液中25(OH)D水平高的患者更易妊娠，認為25(OH)D的水平可以作為IVF-ET妊娠結(jié)局的獨立預(yù)測指標。Rudick等[11]對非亞洲地區(qū)不孕癥患者和亞洲地區(qū)不孕癥患者進行比較后，認為非亞洲地區(qū)患者更易因維生素D缺乏導(dǎo)致妊娠率下降。另外，他們的研究也發(fā)現(xiàn)，維生素D水平與獲卵數(shù)、形成胚胎數(shù)及胚胎質(zhì)量無顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，卵泡液中不同25(OH)D水平的患者獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、受精率及優(yōu)胚率比較，無顯著性差異，提示卵泡液中25(OH)D水平可能與卵母細胞質(zhì)量及胚胎質(zhì)量無太大關(guān)系，且維生素D可能不是通過影響胚胎質(zhì)量來影響妊娠率的。相反，Aleyasin等[12]對82例行IVF助孕治療的不孕癥患者進行研究發(fā)現(xiàn)，血清和卵泡液中25(OH)D水平和IVF妊娠結(jié)局無顯著相關(guān)性。目前關(guān)于維生素D水平是否能預(yù)測妊娠結(jié)局尚存在爭議，我們的研究因為納入樣本數(shù)量較少，存在一定的局限性，可能對結(jié)果造成偏倚，后期仍需擴大樣本量進行深入研究。此外，維生素D水平在不同的時間及季節(jié)可能并不相同，僅通過一項數(shù)據(jù)可能并不能真實反映體內(nèi)維生素D的狀況。

與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的調(diào)控因子有細胞因子、分泌蛋白及核轉(zhuǎn)錄因子(如同源框基因HOXA10和HOXA11)。其中，同源框基因HOXA10和HOXA11在胚胎植入窗期呈高表達[13-14]，維生素D參與二者在子宮內(nèi)膜上的表達。維生素D的補充治療能增加HOXA10 mRNA和蛋白質(zhì)的表達[14]。Ozkan等[10]認為維生素D可能通過影響子宮內(nèi)膜的容受性進而影響IVF-ET的妊娠結(jié)局。Firouzabadi等[15]也認為充足的維生素D水平更易于胚胎著床。有研究還認為，維生素D可能通過降低蛻膜化T細胞的活性及減少細胞因子、白介素-1/6、腫瘤壞死因子(TNF-α)的合成來影響子宮內(nèi)膜的容受性及胚胎種植過程[16]。本研究結(jié)果亦提示高水平的維生素D有利于胚胎種植。本研究進一步對妊娠患者隨訪至孕12周觀察早期流產(chǎn)情況，結(jié)果顯示，各組間的早期流產(chǎn)率比較均無顯著性差異。但蘇貞文等[17]曾報道，稽留流產(chǎn)孕婦存在維生素D缺乏，維生素D缺乏促使細胞免疫功能亢進、輔助性T細胞向Th1細胞偏移，繼而導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。維生素D水平與流產(chǎn)發(fā)生的關(guān)系尚需進一步研究探討。

本研究所納入的患者中，僅3例患者血清25(OH)D水平正常，提示維生素D缺乏可能在不孕癥患者中普遍存在，也有數(shù)據(jù)報道，成年人中約有10%～60%血清 25(OH)D水平低于50 nmol/L[18]。Aflatoonian等[19]對114例行凍融胚胎移植并維生素D缺乏的不孕癥患者隨機分組后，其中57例患者移植前每周補充50 000 U的維生素D治療6～8周，移植后隨訪妊娠結(jié)局發(fā)現(xiàn)，維生素D補充治療并未提高凍融胚胎移植的妊娠率。但Wehr等[20]報道了46例多囊卵巢綜合征(PCOS)患者通過每周補充20 000 U維生素D治療24周后發(fā)現(xiàn)，約有50%的患者治療前月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)癥狀得到了改善。Lerchbaum等[3]指出，維生素D補充治療也許不能大幅改善不孕癥現(xiàn)狀，但其治療安全、實惠，對不孕癥治療可起到輔助作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，維生素D缺乏在不孕癥患者中普遍存在，行IVF-ET助孕治療的患者妊娠率下降可能與維生素D缺乏有關(guān)。高水平的維生素D有利于胚胎種植和妊娠建立，但合理的維生素D補充治療是否能提高IVF-ET助孕的妊娠率，還需要大樣本的隨機對照實驗來證實。

【參考文獻】

[1]Satirapoj B，Limwannata P，Chaiprasert A，et al. Vitamin D insufficiency and deficiency with stages of chronic kidney disease in an Asian population[J]. BMC Nephrol，2013，14：206.

[2]Burgaz A，Orsini N，Larsson SC，et al. Blood 25-hydroxyvitamin D concentration and hypertension：a meta-analysis[J]. J Hypertens，201l，29：636-645.

[3]Lerchbaum E，Obermayer-Pietsch B. Vitamin D and fertility：a systematic review[J]. Eur J Endocrinol，2012，166：765-778.

[4]葉碧綠. 維生素D與多囊卵巢綜合征相關(guān)性的研究進展[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：431-434.

[5]Paffoni A，F(xiàn)errari S，Viganò P，et al. Vitamin D deficiency and infertility：insights from in vitro fertilization cycles[J]. J Clin Endocrinol Metab，2014，99：E2372-2376.

[6]中華醫(yī)學(xué)會 主編. 臨床診療指南輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：157-159.

[7]Binkley N，Krueger D，Lensmeyer G. 25-hydroxyvitamin D measurement，2009：a review for clinicians[J]. J Clin Densitom，2009，12：417-427.

[8]Luk J，Torrealday S，Neal Perry G，et al. Relevance of vitamin D in reproduction[J]. Hum Reprod，2012，27：3015-3027.

[9]Merhi Z，Doswell A，Krebs K，et al. Vitamin D alters genes involved in follicular development and steroidogenesis in human cumulus granulosa cells[J]. J Clin Endocrinol Metab，2014，99：E1137-1145.

[10]Ozkan S，Jindal S，Greenseid K，et al. Replete vitamin D stores predict reproductive success following in vitro fertilization[J]. Fertil Steril，2010，94：1314-1319.

[11]Rudick BJ，Ingles SA，Chung K，et al. Influence of vitamin D levels on in vitro fertilization outcomes in donor-recipient cycles[J]. Fertil Steril，2014，101：447-452.

[12]Aleyasin A，Hosseini MA，Mahdavi A，et al. Predictive value of the level of vitamin D in follicular fluid on the outcome of assisted reproductive technology[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，159：132-137.

[13]Du H，Daftary GS，Lalwani SI，et al. Direct regulation of HOXA10 by 1，25-(OH)2D3 in human myelomonocytic cells and human endometrial stromal cells[J]. Mol Endocrinol，2005，19：2222-2233.

[14]Vitiello D，Kodaman PH，Taylor HS. HOX genes in implantation[J]. Semin Reprod Med，2007，25：431-436.

[15]Firouzabadi RD，Rahmani E，Rahsepar M，et al. Value of follicular fluid vitamin D in predicting the pregnancy rate in an IVF program[J]. Arch Gynecol Obstet，2014，289：201-206.

[16]Pasco JA，Wark JD，Carlin JB，et al. Maternal vitamin D in pregnancy may influence not only offspring bone mass but other aspects of musculoskeletal health and adiposity[J]. Med Hypotheses，2008，71：266-269.

[17]蘇貞文，姚吉龍，姜艷華. 維生素D與稽留流產(chǎn)的免疫相關(guān)性研究[J]. 中國臨床研究，2015，28：280-282.

[18]Thomson RL，Spedding S，Buckley JD. Vitamin D in the aetiology and management of polycystic ovary syndrome[J]. Clin Endocrinol，2012，77：343-350.

[19]Aflatoonian A，Arabjahvani F，Eftekhar M，et al. Effect of vitamin D insufficiency treatment on fertility outcomes in frozen-thawed embryo transfer cycles：A randomized clinical trial[J]. Iran J Reprod Med，2014，12：595-600.

[20]Wehr E，Pilz S，Schweighofer N，et a1. Association of hypovitaminosis D with metabolic disturbances in polycystic ovary syndrome[J]. Eur J Endocrinol，2009，161：575-582.

[編輯：肖曉輝]

Association of 25-hydroxy vitamin D levels in serum or follicular fluid with early pregnancy outcomes of IVF-ET

MA Juan1，HE Yu-jie2*，XU Bing-xue1，YAN Meng-min2，F(xiàn)AN Jing2，LIU Shi-wei2，WANG Yuan1

1. The First Clinical College of Shanxi Medical University，Taiyuan030001

2. The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan030001

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.005

【收稿日期】2015-09-16；【修回日期】2015-12-24

【作者簡介】馬娟，女，山東禹城人，碩士，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*通訊作者，Email：hyj7007@163.com)