高通量生物分析技術及應用研究進展

翟緒昭王廣彬趙亮濤曾海娟李建武丁承超宋春美劉箐

（1. 上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2. 徐州綠健乳業有限責任公司，徐州 221006；3. 甘肅省蘭州大學第二醫院遺傳學研究室，蘭州 730030）

高通量生物分析技術及應用研究進展

翟緒昭1王廣彬2趙亮濤3曾海娟1李建武1丁承超1宋春美1劉箐1

（1. 上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2. 徐州綠健乳業有限責任公司，徐州 221006；3. 甘肅省蘭州大學第二醫院遺傳學研究室，蘭州 730030）

基因組學、蛋白組學、代謝組學等研究的興起使得大量生物數據的快速獲取和分析變得更加重要。傳統的生物分析方法大多耗時、費力，已無法滿足現代生命科學研究對海量生物信息的需要。高通量分析技術是快速獲取大量生物信息的重要手段。對微陣列芯片、微流控芯片、焦磷酸測序、熒光偏振免疫分析、量子點熒光免疫分析等高通量生物分析技術進行了綜述，簡述了近幾年高通量生物分析技術的研究重點和研究成果，并對其在食品安全、醫學等方面的應用進行了簡要介紹。

高通量；芯片；免疫分析技術；食品安全

隨著基因組學、蛋白組學、代謝組學及生物大數據等研究的興起和深入，生物海量數據獲取對常規分析技術提出了挑戰，高通量分析（high throughput screening，HTS）是指同時對一個樣品中的多個指標，或者對多個樣品中的一個指標同步進行并行分析，以在最短的時間內獲得最多的生物信息的新型分析技術。與傳統分析方法相比，HTS具有高通量、并行性、微量化、自動化等優點。按照檢測原理分析靶標的不同，HTS主要包括生物芯片、焦磷酸測序技術、熒光偏振免疫分析技術等，可用于食品安全檢測、醫學診斷、藥物篩選、植物育種、環境監測、司法鑒定等領域。本文綜合國內外HTS最新研究進展，對HTS技術及應用予以分析和評述。

1 HTS技術及研究進展

1.1 微陣列芯片

微陣列芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片、細胞芯片和組織芯片。主要由基片、基片固著物、結果報告系統、芯片掃描及分析軟件4部分組成。基片材料主要有玻璃片、硅片、金屬片、塑料、凝膠、尼龍膜和微孔板等；基片固著物包括核酸探針或捕捉抗體；結果報告系統包括經過熒光或酶標記的核酸或抗體；芯片掃描儀及分析軟件是針對不同的生物芯片設計的對結果進行讀取和分析的專用設備和軟件。

1.1.1 生物芯片基片 不同的基片材料會影響核酸或蛋白質的結合能力、芯片的背景值、樣點均一性、信號強度等，近年來基片表面改性和新型基片材料的研發成為芯片研究的一大熱點。玻璃片和硅片是使用最普遍的固相載體，但成本高、制作過程復雜、易碎。為了克服這些問題，Zhao等［1］研發出了用紙質材料作為基片的生物芯片，然而紙質生物芯片表面容易改性，通量低。尼龍膜、硝酸纖維素膜等主要利用吸附作用來連接蛋白質，對保持相對自由的蛋白質的活性有一定的優勢，但容易造成非特異性吸附和蛋白質的變性［2］。凝膠是一種具有三維網絡結構的聚合物，具有良好的吸水性和生物相容性，能夠很好地保持蛋白質的活性，水凝膠蛋白芯片已成功運用于腫瘤標記物的檢測和體外過敏診斷［3，4］。透明塑料由于其成本低、透明度高、柔韌性好、易于加工等優點適合用于制作芯片，Jing等［5］研發了一種新型的用PC作為基片的芯片，具有低成本、制作簡單、靈敏度高及可視化的特點。開發出低成本、制作簡單、背景值低、結合性能穩定及能保持結合物活性的材料是未來芯片材料研究的重點。

1.1.2 芯片質控系統 微陣列芯片是將大量探針分子整齊排列于固相載體上，然后與標記的樣品分子進行雜交反應獲取檢測信息，探針在固相載體上的固定是芯片制作的關鍵步驟。目前，在芯片點樣過程中所用的緩沖液多為無色的碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液，使得芯片在點樣后仍成無色狀態，無法在芯片使用前對樣點大小、樣點均一性、甚至是否有樣點進行預判。為了解決這一問題，有人在基因芯片的制作過程中對固定在芯片上的核酸進行熒光標記，不僅可對樣點進行預判，而且可以對固定的核酸進行準確的定量［6，7］。Delehanty等［8］將此方法用于蛋白芯片，但是由于蛋白質的結構比核酸復雜，此方法不僅加大了芯片的制作成本（需要用到芯片熒光掃描儀），而且熒光染料容易破壞蛋白質的空間結構。生物染色劑通常不會破壞蛋白質的空間結構且對核酸、蛋白質等染色效果好，Desmet等［9］用1 mg/mL溴酚藍進行樣點質量控制，Qiu等［10］將麗春紅直接加入到蛋白芯片的點樣緩沖液中并對麗春紅的點樣濃度進行了優化，實現了在芯片使用前對樣點的圓潤均勻程度進行預判。用直觀簡單的方法實現對芯片的質量控制對提高芯片檢測結果的可靠性和穩定性意義重大。

1.1.3 芯片結果報告系統 芯片的檢測方法可分為兩種類型：依賴于各種標記的間接法和直接非標記法。對于間接法，標記物的選擇對檢測結果的靈敏度有很大影響，常用的標記物有酶、熒光染料、功能性磁珠、納米顆粒、生物素和膠體金等。Mavrogiannopoulou等［11］用鏈霉親和素/生物素標記寡核苷酸來提高基因芯片的檢測靈敏度，結果顯示雜交信號增強了至少5倍，不僅靈敏度提高而且可以縮短PCR所需時間，加快了檢測效率。Kim等［12］用金納米顆粒標記目標DNA，用場發射掃描電子顯微鏡成像和計算納米顆粒，納米粒子標記的檢測靈敏度可達到1 pM，是熒光標記的1 000倍。制作成本高、操作復雜是制約芯片發展的一個重要原因，李浩林等［13］采用可視化抗體宏陣列、酶標抗體化學顯色等技術制作蛋白芯片，使檢測結果肉眼可見，不需要借助昂貴的儀器，大大降低了芯片制作成本，但是此方法檢測致病菌檢測限僅為105，檢測靈敏度還需要進一步提高。對于直接法，即用物理傳感器記錄傳感器表面由分析物所引起的臨近介質的某些物理特性（如電壓、折射率和質量等）的變化，主要有表面等離子共振法、電化學分析方法和質譜分析方法等。

1.2 微流控芯片

微流控芯片［14，15］是在微流路系統中處理微量液體（10-9-10-18L）的技術，用極少量的樣品和試劑就可完成檢測，已廣泛用于生物醫學領域中，尤其適合在遭受自然災害和資源缺乏的國家或地區進行快速檢測，主要包括PCR芯片、流式芯片、毛細管電泳芯片、微電子芯片、色譜芯片及各類樣品制備芯片等。微流控芯片在生物醫學中的應用主要包括3個部分：細胞、核酸和蛋白質。相比于傳統的檢測方法，微流控芯片的優點有［16］：（1）只需要微量的樣品和試劑，極大降低了檢測成本；（2）在微流控系統中流體始終保持層流，能夠準確控制微流控系統中的流速、壓力和溫度等流動變量；（3）微流控系統比表面積大，能夠在低濃度樣品中快速檢測出細胞、核酸或蛋白，這對于疾病的早期診斷非常重要。

用于制作微流控芯片的傳統材料有硅、玻璃和石英等，主要采用刻蝕加工。高分子聚合物由于成本低、易于加工、具有良好的生物相容性等優點正日益成為微流控芯片的主要材料。目前，已有多種高分子聚合物材料被用于芯片制作，如聚酰胺（PA）、聚碳酸酯（PC）、聚對苯二甲酸丁二醇酯（PBT）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基苯烯酸甲酯（PMMA）等。COC（環烯烴類共聚物）具有與PMMA相匹敵的光學性能以及具有高于PC的耐熱性，低吸濕性和良好的化學穩定性，因而COC在微流控芯片領域有很好的應用前景，Roy等［17］證明用 N-乙烯吡咯烷酮單體進行改性的COC表面具有很高的粘結強度、表面濕潤度和透明度以及很好的生物相容性。用聚合物材料制作微流控芯片常用的方法主要有熱壓成型法和注塑成型法，與熱壓成型相比，注塑成型能夠降低生產成本，提高芯片生產效率，適合大批量生產［18］。宋滿倉等［19］采用UVLIGA技術制作成型微通道的型芯，設計制造了微流控芯片注塑模具并研究了各工藝參數對微通道復制度的影響，研究表明模具溫度是主要影響因素，注射速度和熔體溫度次之，由此形成的注塑工藝，對于寬80 μm、深50 μm 截面的微通道而言，可使微通道復制度由70%提高到90%。Matteucci等［20］用硅干法刻蝕、電鍍法和注塑成型相結合制作微流控芯片并對制作工藝進行了優化，此方法制作的芯片能夠很好地用于細胞捕獲和DNA延伸。微流控芯片已突破其在加工制作技術上的難關，以微流控芯片為核心的微全分析系統將有望取代很多生物化學實驗設備，走進實驗室和生活中。

1.3 焦磷酸測序技術

焦磷酸測序技術是基于合成測序的一種新的DNA測序方法，這種實時熒光DNA測序技術是采用四種酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）的酶聯級聯化學發光反應，該技術已被證明適合用來進行單核苷酸多態性分析和DNA短序列的測序［21］。焦磷酸測序技術不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進行任何形式的標記或染色，具有高通量、低成本、直觀、高效的特點。可以應用于單核苷酸多態性（SNP）分析、突變檢測、病原微生物快速檢測、法醫鑒定等。

雖然焦磷酸測序技術有上述很多優點，但要提高信號的強度，確保測序的準確性，還需要進行進一步的研究。如PCR參數的變化、測序引物的設計、樣品的制備、核苷酸的配比等。測序中引物設計的不合理會導致測序信號值過低或者非特異性背景值過高，最終導致測序失敗。葉卉等［22］系統研究了焦磷酸測序中引物的設計方法，得出提高PCR引物的多聚酶親和指數有利于增強擴增效率與測序結果的信號峰強度，測序方向和dNTP 推注順序的不合理選擇會嚴重干擾部分SNP測序結果的判斷。Groth等［23］用載體連接和生物素標記的方法制備焦磷酸測序單鏈DNA模板，單鏈DNA模板比雙鏈DNA模板用于焦磷酸測序效果更好。隨著對PCR參數的優化，對測序引物的改進以及對其他條件的改善，焦磷酸測序將有更高的靈敏度和特異性。

1.4 熒光偏振免疫分析技術

熒光偏振免疫分析技術（FPIA）是一種競爭性免疫分析方法，利用熒光素經單一波長的偏振光照射后能吸收光能并發出相應的偏振熒光，偏振熒光的強弱程度與熒光分子的大小呈正相關。待測物中抗原濃度高時，熒光標記抗原與抗體結合少，多呈游離狀態，分子小，熒光偏振程度低；反之，當待測物中抗原濃度低時，熒光標記抗原多與抗體結合，分子大，熒光偏振程度高［24］。

熒光偏振免疫分析技術具有操作簡便，快速，自動化，準確性好，靈敏度高，高通量的優點，只需將樣品、抗體和示蹤劑3種試劑混合后孵育幾分鐘甚至幾秒鐘就可以得到檢測結果。Sheng等［25］用FPIA進行黃曲霉毒素的檢測，研究顯示完成微孔板上96種樣品的檢測總時間不超過5 min。無需將熒光標記物與非標記樣品進行分離是FPIA的優點之一，但是為了避免靈敏度的降低，需要一種快速、簡單的純化方法有效去除試劑中影響檢測靈敏度的雜質，Beloglazova等［26］研究了一種用FPIA檢測啤酒中黃曲霉毒素B1的方法并采用氨基修飾硅膠吸附劑固相萃取法對檢測樣品進行純化，該純化方法簡便、快速，有效去除了樣品中的雜質，保證了檢測靈敏度。

1.5 量子點熒光免疫分析技術

作為一種發光半導體納米晶體，與傳統的有機熒光染料相比，量子點具有優越的光學性能，寬且連續的吸收光譜，較大的斯托克位移和狹窄對稱的熒光發射光譜，因而被廣泛用作熒光免疫分析的標記物用于致病菌，蛋白質和小分子物質的檢測，可以顯著提高檢測靈敏度和分辨率，在高通量免疫分析中具有重要作用。Zhu等［27］用一種基于雙色量子點和酶的免疫分析技術同時檢測牛奶中的多種化學物質，但是只實現定量檢測，Song等［28］用量子點熒光免疫分析方法進行牛奶中鏈霉素、四環素、青霉素的同時定性和定量檢測，檢測限達到5 pg/mL。

提高量子點的發光強度和抗體的穩定性是量子點熒光免疫分析方法的研究重點之一，王洪江等［29］以巰基乙酸為穩定劑，采用水相合成方法制備了CdS量子點，成功將單增李斯特菌抗體與CdS偶聯，偶聯后的IgG-CdS熒光強度為偶聯前的4倍。楊淑平等［30］研究發現谷胱甘肽穩定劑優于巰基乙酸，由于其碳鏈較長，減少了量子點對抗體尤其是活性位點處空間構型的影響，大大提高了抗體的穩定性，與CdTe量子點相比，谷胱甘肽修飾的CdTe/Cds量子點熒光強度和穩定性分別提高6倍和2倍以上。

1.6 多重PCR

多重PCR就是在同一PCR反應體系中加入兩對或兩對以上的引物，同時對多個模板或同一個模板的不同區域進行擴增的PCR技術。其反應原理、反應試劑和操作過程與普通PCR相同。近年來，多重PCR廣泛應用于動植物病原檢測、食品安全性檢測、疾病診斷等領域中。多重PCR雖然具有簡便、快速、經濟、高效的特點，但目前也還存在一些問題，如反應靈敏度低、某一特定片段的優先擴增、容易形成引物二聚體等［31］。這些問題需要通過不斷優化反應體系和反應條件來解決。

在建立多重PCR體系時，多重PCR引物的設計是非常關鍵的，決定了多重PCR的成敗。主要需要考慮以下幾方面：（1）引物對之間是否有相近的Tm值，相近的Tm值能夠保證在同一退火溫度下實現對所有目的片段的同時擴增；（2）是否會形成引物二聚體，引物二聚體的形成原因主要有體系中引物過多、體系中模板的量太少、引物設計過程中的誤差等；（3）引物之間的配比和濃度，一般多重PCR中每對引物的濃度都應該低于單一引物PCR中的濃度；（4）各個擴增產物的長度，擴增產物的長度應該有適當地區別，以便在電泳圖譜上能夠清楚地區分出各個目的條帶；（5）各個引物對的特異性。Liu等［32］在設計多重PCR引物時，設計的所有引物有相似的退火溫度（59-61℃），并對各個引物進行仔細分析，避免形成引物二聚體，實現了對造成煙草叢頂病的4種常見病毒的同時檢測。

在優化PCR反應條件時，建議重點優化退火溫度和延伸時間。退火溫度通常是根據解鏈溫度設定的，單一引物PCR中退火溫度為56-60℃時適合特異性擴增，但多重PCR中溫度降低4-6℃更適于所有目的片段的擴增［33］。Zong等［34］用多重逆轉錄PCR同時檢測甜櫻桃中常見的4種病毒（PNRSV、PDV、LChV-2和CGRMV），在對反應條件進行優化時，用梯度PCR的方法摸索最佳退火溫度，結果顯示退火溫度為47-50℃時4個目的片段的基因擴增效果最好。延伸時間需要根據模板核酸的長度決定，多重PCR的延伸時間比普通PCR延伸時間稍長，擴增效果會更好［35］。

2 HTS的應用

2.1 在食品安全檢測方面的應用

食品安全問題與每個人的生活息息相關，但近年來食品安全問題日益凸出，為了保證食品的健康與安全，食品檢測技術急需向著快速、簡便、高通量的方向發展。食品檢測主要包括食源性致病菌的檢測、轉基因食品的檢測、食物中農獸藥殘留物的檢測等。高通量檢測技術的發展為食品檢測提供了很多高效的檢測方法。

在食源性致病菌的檢測方面，許多研究者用各種HTS對食源性致病菌的檢測進行了研究，在提高其檢測通量、降低其檢測成本的同時，提高了檢測的靈敏度和準確性。現將部分檢測結果歸納，如表1所示。

表1 各種高通量分析技術對食源性致病菌的檢測

在轉基因食品的檢測方面，Zhou等［42］用多重PCR與基因芯片相結合的方法檢測草甘膦轉基因大豆，當轉基因作物含量為0.5%時仍可以檢驗出來，具有很高的靈敏度和準確性。趙胤澤和汪琳等［43］設計了能同時檢測3種轉基因成分的蛋白芯片，并具有較高的靈敏性、特異性和可靠性。Obeid等［44］建立了一個微流控芯片系統用來檢測轉基因大豆，僅需60 s 即可完成分析，產物檢出限低至0.1%，相當于20個拷貝數。

在農獸藥殘留的檢測方面，劉楠等［45］設計了一種可同時檢測4種獸藥、3種農藥的液相芯片，整個檢測過程僅耗時1-2 h。博奧生物技術有限公司構建了一種能夠同時檢測9種獸藥殘留的蛋白芯片平臺，在3-5 h內能檢測出豬肉等組織中的磺胺類、恩諾沙星、氯霉素、鏈霉素類等9種獸藥殘留量，已應用于多個地區的出入境檢驗檢疫部門［46］。郭紅斌等［47］成功制作出一種用于檢測有機磷農藥的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控傳感器，簡單的制備工藝和便攜式的器件為集成化的有機磷農藥檢測裝置提供了低成本和大批量生產的選擇途徑。 Xu等［48］用熒光偏振免疫分析技術進行蔬菜和水樣品中的有機磷農藥類的檢測，能夠同時檢測5種有機磷農藥，檢測限為10 ng/mL，檢測時間不超過10 min。

高通量檢測技術在食品檢測中的應用大大加快了食品檢測的速度，與傳統檢測方法相比具有高通量、快速、靈敏度高的特點，但是還存在檢測結果不夠穩定，檢測通量有待進一步提高等問題，若要進一步取代傳統檢測方法的地位還需要往更簡便、更高效、更穩定的方向發展。

2.2 在醫學領域中的應用

生物醫學的發展使人們逐漸認識到疾病的發生與發展與基因的變化和基因的表達水平密切相關，從基因和蛋白質水平去研究疾病更能揭示疾病的本質。高通量檢測技術的發展為人們從分子生物學水平研究醫學提供了快速、高效、可靠的檢測手段，尤其是在于疾病的診斷和預警、藥物的研究與開發等方面具有廣闊的應用前景。

在疾病診斷和預警方面，高通量檢測技術主要可用于傳染病、自身免疫性疾病、腫瘤的檢測。高通量分析技術因其快速、高效的特點對疾病的早期預防、快速診斷有重要意義。近年來，高通量分析技術應用于疾病的研究有很多，現將部分歸納，如表2所示。

藥物篩選是指用適當的方法對天然物質或人工合成的化合物進行藥物活性檢測，篩選出藥靶用于新藥的開發。傳統的藥物篩選多采用動物模型法，具有實驗存在種屬差異，周期長，成本高等缺點。高通量分析技術用于藥物的篩選具有分析速度快、高通量、所用試劑量少等諸多優勢，克服了傳統藥物篩選方法的不足。Li等［56］用基因芯片來探究中藥的機制，尋找中藥的藥靶以及預測其治療潛力，分析所開發藥物的安全性。鄭永煥等［57］設計了一種能夠實現細胞區域分布培養以及能夠對微流體進行操控的微流控芯片，通過對芯片3種共培養細胞活性的檢測和藥物伊立替康（CTP-11）對肝癌細胞的濃度梯度刺激等實驗結果驗證該芯片在細胞研究和藥物篩選等方面的可行性。

高通量分析技術為疾病的快速、有效診斷以及藥物的高效、低成本篩選提供了很多有效的方法，促進了生物醫學在分子水平的研究，加深了人們對疾病的發生過程以及藥物的作用機制的認識，有利于研究者更好地治療疾病、開發藥物。

2.3 在其他方面的應用

除了上述兩方面，高通量還廣泛用于其他領域。在植物學方面，Li等［58］用基因芯片分析了青梅和杏的差異表達基因，找出兩個基因在表達水平上有顯著差異，為說明這兩種果實在發育和成熟過程中的品質差異提供了詳細的資料。譚小勇等［59］在建立各種病毒單項PCR 技術的基礎上，通過優化多重PCR 反應條件，建立了能同時檢測香蕉中3 種病毒的多重PCR 檢測體系，對其靈敏度測試結果顯示從相當于或大于10-2mg 感病植物組織中均能檢測到這3 種病毒。在土壤學方面，井趙斌等［60］用焦磷酸測序技術對黃土區不同封育時期典型草地土壤真核生物多樣性進行了研究。結果表明不同封育時期草地真菌群落組成具有各自的優勢菌群，動物群落組成僅在種水平存在差異，可以結合土壤微生物和土壤養分恢復時間的閾值對封育草地進行合理利用。在司法鑒定方面，Divne等［61］用焦磷酸測序技術進行STR（short tandem repeats）標記物的分析，這在法醫DNA分析中非常有用。上海市公安局物證鑒定中心利用蛋白芯片技術建立了一種快速、高通量的毒品定量檢測方法，檢測結果與GM-MS儀器比較后總的相關性在88%以上，靈敏度高達99%。可見，蛋白芯片是一種大量、快速檢測毒品的有效手段［62］。

表2 各種高通量分析技術應用于疾病診斷

3 結語

高通量生物分析技術對于現代食品生物醫藥領域的發展意義重大，加快了檢測效率、降低了檢測成本、簡化了檢測過程，為致病菌的快速檢測、疾病的提早預防、食品安全的有效保障等提供了多種全新、高效的檢測方法。近年來，高通量分析技術主要朝著微量化、自動化、高靈敏度、高通量、低成本的方向發展。雖然目前還存在結果穩定性不好、檢測靈敏度不夠、背景值過高、檢測標準不統一等問題，但隨著眾多研究者們不斷對各種HTS技術進行優化和改進，高通量生物分析技術將為未來食品和生物醫藥領域的發展作出巨大的貢獻。

［1］ Zhao W, Ali MM, Aguirre SD, et al. Paper-based bioassays using gold nanoparticle colorimetric probes［J］. Analytical Chemistry, 2008, 80（22）：8431-8437.

［2］ 肖守軍, 陳凌, 許寧. 生物芯片進展［J］. 化學進展, 2009, 21（11）：2397-2410.

［3］ Zubtsova ZI, Savvateeva EN, Butvilovskaya VI, et al. Immunoassay of nine serological tumor markers on a hydrogel-based microchip［J］.Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, 39（6）：619-628.

［4］ Feyzkhanova GU, Filippova MA, Talibov VO, et al. Development of hydrogel biochip for in vitro allergy diagnostics［J］. Journal of Immunological Methods, 2014, 406：51-57.

［5］ Jing W, Shi X, He Y, et al. Novel plastic biochips for colorimetric detection of biomolecules［J］. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2012, 404（6-7）：1935-1944.

［6］ Cretich M, Damin F, Chiari M, et al. Protein microarray technology：how far off is routine diagnostics?［J］. Analyst, 2014, 139, 528-542.

［7］ Hessner MJ, Wang X, Hulse K, et al. Three color cDNA microarrays：quantitative assessment through the use of fluoresceinlabeled probes［J］. Nucleic Acids Research, 2003, 31（4）：31-42.

［8］ Delehanty JB, Ligler FS. Method for printing functional protein microarrays［J］. Biotechniques, 2003, 34（2）：380-385.

［9］ Desmet C, Goff GCL, Brès JC, et al. Multiplexed immunoassay for the rapid detection of anti-tumor-associated antigens antibodies［J］. Analyst, 2011, 136（1）：2918-2924.

［10］ Qiu S, Song CM, Zhao SG, et al. A new spot quality control for protein macroarray based on immunological detection［J］. Talanta, 2015, 138（1）：176-182.

［11］ Mavrogiannopoulou E, Petrou PS, Koukouvinos G, et al. Improved DNA microarray detection sensitivity through immobilization of preformed in solution streptavidin/biotinylated oligonucleotide conjugates［J］. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2015, 128：464-472.

［12］ Kim H, Takei H, Yasuda K. Quantitative evaluation of a goldnanoparticle labeling method for detecting target DNAs on DNA microarrays［J］. Sensors & Actuators B Chemical, 2010, 144（1）：6-10.

［13］ 李浩林, 劉箐, 劉芳, 等. 基于可視化抗體宏陣列技術的出血性大腸桿菌O157∶H7定量檢測［J］. 食品科學, 2014, 35（20）：185-191.

［14］ Zheng GX, Li YJ, Qi LL, et al. Marine phytoplankton motility sensor integrated into a microfluidic chip for high-throughput pollutant toxicity assessment［J］. Marine Pollution Bulletin, 2014, 84（1-2）：147-154.

［15］ Ertl P, Sticker D, Charwat V, et al. Lab-on-a-chip technologies for stem cell analysis［J］. Trends in Biotechnology, 2014, 32（5）：245-253.

［16］ Baratchi S, Khoshmanesh K, Sacristán C, et al. Immunology on chip：promises and opportunities［J］. Biotechnology Advances, 2014, 32（2）：333-346.

［17］ Roy S, Yue CY, Venkatraman SS, et al. Fabrication of smart COC chips：Advantages of N-vinylpyrrolidone（NVP）monomer over other hydrophilic monomers［J］. Sensors & Actuators B Chemical, 2013, 178（3）：86-95.

［18］ 龐中華, 宋滿倉, 劉瑩, 等. 微流控芯片技術的現狀與發展［J］.塑料, 2010（3）：11-13.

［19］ 宋滿倉, 劉瑩, 祝鐵麗, 等. 塑料微流控芯片的注塑成型［J］.納米技術與精密工程, 2011, 9（4）：329-334.

［20］ Matteucci M, Christiansen TL, Tanzi S, et al. Fabrication and characterization of injection molded multi level nano and microfluidic systems［J］. Microelectronic Engineering, 2013, 111（4）：294-298.

［21］ Gharizadeh B, Akhras M, Nourizad N, et al. Methodological improvements of pyrosequencing technology［J］. Journal of Biotechnology, 2006, 124（3）：504-511.

［22］ 葉卉, 劉云龍, 鄒秉杰, 等. 焦磷酸測序中PCR引物與測序引物的設計［J］. 分析化學, 2013, 41（5）：744-748.

［23］ Groth M, Huse K, Reichwald K, et al. Method for preparing singlestranded DNA templates for Pyrosequencing using vector ligation and universal biotinylated primers［J］. Analytical Biochemistry, 2006, 356（2）：194-201.

［24］ Ren L, Meng M, Peng W, et al. Determination of sodium benzoate in food products by fluorescence polarization immunoassay［J］. Talanta, 2014, 121：136-143.

［25］ Sheng YJ, Eremin S, Tie Jun MI, et al. The development of a fluorescence polarization immunoassay for aflatoxin detection［J］. Biomedical & Environmental Sciences, 2014, 27（2）：126-129.

［26］ Beloglazova NV, Eremin SA. Rapid screening of aflatoxin B1 in beer by fluorescence polarization immunoassay［J］. Talanta, 2015, 142（1）：170-175.

［27］ Zhu K, Li J, Wang Z, et al. Simultaneous detection of multiple chemical residues in milk using broad-specificity antibodies in a hybrid immunosorbent assay［J］. Biosensors & Bioelectronics, 2011, 26（5）：2716-2719.

［28］ Song E, Yu M, Wang Y, et al. Multi-color quantum dot-based fluorescence immunoassay array for simultaneous visual detectionof multiple antibiotic residues in milk［J］. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 72（15）：320-325.

［29］ 王洪江, 柳婷, 謝躋, 等. CdS量子點制備與單增李斯特菌抗體偶聯的研究［J］. 分析化學, 2010, 38：632-637.

［30］ 楊淑平, 金鑫, 鄭佳, 等. 高性能CdTe/CdS核殼型量子點的制備及應用于小麥面粉中嘔吐毒素的熒光免疫檢測研究［J］.化學學報, 2011, 6：687-692.

［31］ 趙紅慶, 苑錫銅, 黃留玉. 多重PCR技術在病原檢測中的應用［J］. 生物技術通訊, 2007, 18（5）：863-865.

［32］ Liu F, Tan G, Li X, et al. Simultaneous detection of four causal agents of tobacco bushy top disease by a multiplex one-step RTPCR［J］. Journal of Virological Methods, 2014, 205c：99-103.

［33］ Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, et al. Multiplex PCR：critical parameters and step-by-step protocol［J］. Biotechniques, 1997, 23（3）：504-511.

［34］ Zong X, Wang W, Wei H, et al. A multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of four viruses from sweet cherry［J］. Scientia Horticulturae, 2014, 180：118-122.

［35］ 黃銀花, 胡曉湘, 徐慰倬, 等. 影響多重PCR擴增效果的因素［J］. 遺傳, 2003, 25（1）：65-68.

［36］ Suo B, He Y, Paoli G, et al. Development of an oligonucleotidebased microarray to detect multiple foodborne pathogens［J］. Molecular & Cellular Probes, 2010, 24（2）：77-86.

［37］ Karoonuthaisiri N, Charlermroj R, Uawisetwathana U, et al. Development of antibody array for simultaneous detection of foodborne pathogens［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 24（6）：1641-1648.

［38］ Sun Z, Peng Y, Zhang M, et al. Simultaneous and highly sensitive detection of six different foodborne pathogens by high-throughput suspension array technology［J］. Food Control, 2014, 40（2）：300-309.

［39］ Germini A, Masola A, Carnevali P, et al. Simultaneous detection of Escherichia coli O175：H7, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes by multiplex PCR［J］. Food Control, 2009, 20（8）：733-738.

［40］ 趙新, 王永, 蘭青闊, 等. 焦磷酸測序技術在4種食源性致病菌快速檢測中的應用［J］. 食品與生物技術學報, 2013, 32（2）：182-188.

［41］ Wang B, Wang Q, Cai Z, et al. Simultaneous, rapid and sensitive detection of three food-borne pathogenic bacteria using multicolor quantum dot probes based on multiplex fluoroimmunoassay in food samples［J］. LWT-Food Science and Technology, 2015, 61：368-376.

［42］ Zhou PP, Zhang JZ, You YH, et al. Detection of genetically modified crops by combination of multiplex PCR and low-density DNA microarray1［J］. Biomedical and Environmental Sciences, 2008, 21（1）：53-62.

［43］ 趙胤澤, 汪琳, 邢佑尚, 等. 3種轉基因成分檢測蛋白芯片的研制［J］. 植物檢疫, 2011, 25（3）：1-6.

［44］ Obeid PJ, Christopoulos TK, Ioannou PC. Rapid analysis of genetically modified organisms by in-house developed capillary electrophoresis chip and laser-induced fluorescence system［J］. Electrophoresis, 2004, 25（6）：922-930.

［45］ 劉楠, 蘇璞, 朱茂祥, 等. 高通量懸浮芯片技術檢測多農獸藥殘留［J］. 分析化學, 2010, 38（5）：673-677.

［46］ 陳愛亮, 王國青, 王艷, 等. 獸藥殘留蛋白芯片檢測系統的研制和應用［J］. 中國醫療器械信息, 2008, 14（8）：33-36.

［47］ 郭紅斌, 陳國平, 蘭文升, 等. 一種用于有機磷農藥檢測的微流控傳感器［J］. 傳感器與微系統, 2011, 30（6）：84-86.

［48］ Xu ZL, Qiang W, Lei HT, et al. A simple, rapid and high-throughput fluorescence polarization immunoassay for simultaneous detection of organophosphorus pesticides in vegetable and environmental water samples［J］. Analytica Chimica Acta, 2011, 708（1-2）：123-129.

［49］ Huang W, Hu C, Zeng H, et al. Novel systemic lupus erythematosus autoantigens identified by human protein microarray technology［J］. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2012, 418（2）：241-246.

［50］ Yang Z, Chevolot Y, Ataman-?nal Y, et al. Cancer biomarkers detection using 3D microstructured protein chip：implementation of customized multiplex immunoassay［J］. Sensors and Actuators B Chemical, 2012, 175（12）：2228.

［51］ Kang JH, Vanderstichele H, Trojanowski JQ, et al. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease［J］. Methods, 2012, 56（4）：484-493.

［52］ Liang Z, Dong M, Cheng Q, et al. Gestational diabetes mellitus screening based on the gene chip technique［J］. Diabetes Research & Clinical Practice, 2010, 89（2）：167-173.

［53］ Tian J, Zhou L, Zhao Y, et al. Multiplexed detection of tumormarkers with multicolor quantum dots based on fluorescence polarization immunoassay［J］. Talanta, 2012, 92（1）：72-77.

［54］ Smith AM, Dave SS, True L, et al. Multicolor quantum dots for molecular diagnostics of cancer［J］. Expert Review of Molecular Diagnostics, 2014, 6（2）：231-244.

［55］ Hallur V, Sharma M, Sethi S, et al. Development and evaluation of multiplex PCR in rapid diagnosis of abdominal tuberculosis［J］. Diagnostic Microbiology & Infectious Disease, 2013, 76（1）：51-55.

［56］ Li CC, Lo HY, Hsiang CY, et al. DNA microarray analysis as a tool to investigate the therapeutic mechanisms and drug development of Chinese medicinal herbs［J］. Biomedicine, 2012, 2（1）：10-16.［57］ 鄭允煥, 吳建璋, 邵建波, 等. 用于藥物篩選的微流控細胞陣列芯片［J］. 生物工程學報, 2009, 25（5）：779-785.

［58］ Li X, Korir NK, Liu L, et al. Microarray analysis of differentially expressed genes engaged in fruit development between Prunus mume and Prunus armeniaca［J］. Journal of Plant Physiology, 2012, 169（17）：1776-1788.

［59］ 譚小勇, 阮小蕾, 吳麗婷, 等. 香蕉3種病毒的多重PCR檢測體系［J］. 園藝學報, 2010, 37（5）：829-834.

［60］ 井趙斌, 程積民, 張寶泉, 等. 基于454焦磷酸測序法的典型草原土壤真核生物多樣性［J］. 草業科學, 2013, 30（11）：1690-1697.

［61］ Divne AM, Edlund H, Allen M. Forensic analysis of autosomal STR markers using Pyrosequencing［J］. Forensic Science International Genetics, 2010, 4（2）：122-129.

［62］ 曾立波, 陳連康, 胡小龍, 等. 定量檢測毒品的蛋白芯片的研發［J］. 中國司法鑒定, 2012（1）：16-19.

（責任編輯 狄艷紅）

An Overview of High Throughput Biological Screening Methods and Its Application

ZHAI Xu-zhao1WANG Guang-bin2ZHAO Liang-tao3ZENG Hai-juan1LI Jian-wu1DING Cheng-chao1SONG Chun-mei1LIU Qing1
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093；2. Xuzhou Lüjian Dairy Co.，Ltd，Xuzhou 221006；3. Laboratory of Medical Genetics，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030）

The emergence of genomics，proteomics，metabolomics and other molecular biology studies makes the rapid attainment and assessment of large amounts of biological data become extremely important. The traditional detection methods are time-consuming and laborious，and cannot satisfy the needs of contemporary biological science research for massive biological information. High Throughput Screening（HTS）methods are significant means of quick attainment of massive biological information. This paper will make an overview of microarray chip，microfluidic chip，pyrosequencing，fluorescence polarization immunoassay，quantum dot fluorescence immunoassay and multiple PCR，outline research focus and research results of HTS methods in recent years，and briefly introduce its application in food safety，medicine and other fields.

high throughput；chip；immunoassay；food safety

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.007

2015-08-31

上海市科委高校能力建設項目（13430502400），“科技創新行動計劃” 長三角科技聯合攻關領域項目（15395810900），乳制品生產體系致病菌快速檢測（3A15308006）

翟緒昭，女，碩士研究生，研究方向：食源性致病菌快速檢測；E-mail：huzhxzh@126.com

劉箐，男，博士，教授，研究方向：食源性致病菌致病機理及快速檢測技術；E-mail：liuq@usst.edu.cn