阿霉素誘導下的肝癌細胞HepG2中微小RNA差異表達分析

楊亞藍 郭志云 丁若凡 茆燦泉 郭建秀 熊莉麗

（西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

阿霉素誘導下的肝癌細胞HepG2中微小RNA差異表達分析

楊亞藍 郭志云 丁若凡 茆燦泉 郭建秀 熊莉麗

（西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

旨在研究阿霉素誘導引起的DNA損傷壓力下，肝癌細胞HepG2中參與DNA損傷應答的miRNA，并分析這些miRNA靶基因參與肝癌DNA損傷應答相關的生物學進程與通路。通過小RNA測序檢測阿霉素處理肝癌細胞HepG2前后miRNA的差異表達情況，使用GO與KEGG通路富集方法對差異表達miRNA靶基因進行功能富集分析。結果顯示，共檢測出顯著表達差異miRNA 68個，其中上調13個，下調55個。miRNA靶基因的功能分析結果顯示，53條miRNAs靶基因顯著富集于調控細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移和細胞周期等與DNA損傷應答以及腫瘤相關的生物進程和信號通路，包括p53信號通路、癌癥通路、Wnt信號通路和MAPK信號通路等。研究表明，在阿霉素誘導下，HepG2中的差異表達miRNAs與DNA損傷相關的腫瘤生物學進程以及信號通路顯著相關，預示這些miRNAs在阿霉素引發的肝細胞癌DNA損傷應答中起著重要的作用。

阿霉素；肝細胞癌；DNA損傷；小RNA測序；microRNAs

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）是人類最常見的惡性腫瘤之一［1，2］。MiRNA是一種內源性非編碼RNA，長度在22個核苷酸左右，它主要是通過特異性結合靶基因3'非翻譯區（3'UTR）抑制靶基因的翻譯或者直接誘導靶基因的降解從而調控下游靶基因參與的生物進程［3］。研究表明miRNAs參與了由DNA損傷應答相關的多種細胞生物過程，包括細胞增殖、細胞周期調控和細胞凋亡等［4，5］。Andrea等［6］發現，原癌基因miR-27a在人肺腺癌細胞A549 DNA損傷反應中起到重要的作用，其主要通過直接調控ATM基因進而抑制肺癌細胞的增殖。小RNA測序技術（small RNA sequencing）作為一種高通量的miRNA檢測技術，目前廣泛應用于miRNA表達譜的檢測。本研究利用抗癌藥物阿霉素處理肝癌細胞株HepG2，使細胞產生特異的DNA損傷，并運用小RNA測序技術檢測阿霉素處理前后肝癌細胞株HepG2的miRNAs表達譜，篩選出DNA損傷前后差異性表達miRNAs，旨在為進一步研究肝細胞癌的DNA損傷應答機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞HepG2由本實驗室保管；阿霉素購自sigma公司；DMEM培養基購自Gibco公司；100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素以及胎牛血清購自Hyclone公司；Trizol Regent購自Invitrogen公司；測序由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞HepG2用含有10%胎牛血清（Hyclone），100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素（Hyclone）的DMEM培養基（Gibco）培養，并置于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中進行培養。取對數期5.0×106個細胞接種于60 mm培養皿中，待長至80%左右，加入0.2 μg/mL的阿霉素（北京華豐）處理HepG2細胞，24 h后收集細胞。

1.2.2 RNA提取及質量檢測 收集經阿霉素處理前后HepG2細胞，按TRIzol（Invitrogen）實驗說明書抽提細胞總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳和酶標儀（百泰克）鑒定RNA的純度及完整性。

1.2.3 Small RNA文庫構建及測序 使用15%PAGE膠分離不同片段大小的RNA，回收18-30 nt的片段在T4 RNA連接酶作用下加5'和3'測序接頭將產物反轉錄為雙鏈并擴增。使用PAGE膠對PCR擴增產物切膠回收及純化，回收產物溶于EB溶液中，完成文庫建立。使用Agilent 2 100 Bioanalyzer和StepOnePlus Real-Time PCR System對構建好的small RNAs文庫進行質量及產量評估。參照Illumima HiSeq 2 500測序儀說明書完成small RNAs文庫測序。

1.2.4 Small RNA測序數據分析 Illumina HiSeq 2 500測序得到長度為49 nt的序列，通過數據處理去除3'端缺失、5'端污染、插入片段缺失、含polyA等序列后獲得高質量clean reads。對clean reads的長度、質量和分布等進行統計、分類和注釋。通過bowtie將sRNA定位到基因組，分析reads在基因組上的分布及表達情況。使用bowtie將reads與miRBase數據庫進行比對，注釋已知miRNAs。通過bowtie將sRNA和GeneBank、Rfam數據庫比對，注釋除miRNA以外的sRNA，沒有比對到注釋信息的sRNA用unann表示。

1.2.5 差異表達miRNAs分析 篩選實驗組與對照組文庫差異表達miRNA，將兩個文庫中的miRNA歸一化處理后進行倍數變化值（fold change）和P值統計計算。篩選顯著性差異表達miRNA的具體標準如下：（1）reads數大于10；（2）|log2（fold change）|>1；（3）P<0.05。

1.2.6 miRNAs靶基因預測、功能分析 利用Targetscan（http://www.targetscan.org/）［7］、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/ home.do）［8］和miRDB（http://www.mirdb.org/miRDB/）［9］數據庫對顯著性差異表達的miRNA進行靶基因預測，通過取交集來降低靶基因預測假陽性率。將預測靶基因與實驗驗證靶基因庫TarBase（http://diana.imis.athenainnovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/index）［10］取并集得到每個miRNA的靶基因數據集。利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）［11，12］對 每 個miRNA的靶基因進行Gene Ontology［10］富集分析和KEGG信號通路分析，以P<0.05為顯著性閾值。

2 結果

2.1 總RNA提取和檢測

使用0.2 μg/mL阿霉素處理HepG2細胞0 h和24 h后，TRIzol試劑抽提樣本中總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和酶標儀檢測總RNA含量和質量。各組樣本總RNA的OD260/OD280均在1.8-2.0之間，樣品濃度在500-1 000 ng/μL之間。1%瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1）顯示2個樣品的28S和18S電泳條帶清晰，灰度比大于1.9，質量合格，可用于后續測序實驗。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 對照組和實驗組樣本中small RNA占比柱狀圖

圖3 對照組與實驗組樣本miRNA種類的比較

圖4 差異表達miRNAs散點圖

2.2 小RNA測序數據分析

測序得到對照組和實驗組總reads分別為11 519 591條和12 110 255條，高質量數據占總數的98.95%和97.96%。通過bowtie將sRNA與miRbase、Rfam和GenBank等數據庫比對進行sRNA種類注釋。正如預期，sRNA中miRNA占有最高的比例，對照組和實驗組中miRNA占比分別為53.01%和45.51%（圖2）。對照組樣本中檢測到888種成熟miRNAs，實驗組樣本中檢測到790種成熟的miRNA，兩個樣本中均表達的有679種（圖3）。

2.3 阿霉素處理組與對照組樣本miRNAs差異表達分析

將阿霉素處理組和對照組miRNA的表達量豐度進行比較后共得到127個差異表達miRNA（P<0.05）（圖4）。通過進一步篩選得到顯著差異表達miRNA共68條（13條上調miRNA，55條下調miRNA）（表1）。上調最為顯著的是hsa-miR-449c-5p（上調50.14倍）。miR-17-92基因簇中的miR-19b、miR-20a、miR-18a、miR-92a-1在本實驗中均呈現下調趨勢。

2.4 差異表達miRNA功能富集分析

運 用Targetscan、miRanda、miRDB和TarBase四種軟件組合預測了差異表達miRNAs的靶基因（參照材料與方法部分）。通過GO富集分析和KEGG信號通路分析對每個表達差異的miRNA靶基因進行功能注釋（P<0.05）。我們發現68條表達差異miRNAs中有53條miRNAs的靶基因顯著參與細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期調控、細胞遷移等與DNA損傷應答相關的生物進程和信號通路，如p53信號通路（最小P值=6.90E-09）、MAPK信號通路（最小P值=2.60E-05）、癌癥中通路（pathways in cancer）（最小P值=5.10E-10）等（圖5）。其中hsa-miR-148a-3p（最小P值= 1.20E-08）、hsa-miR-122-5p（最小P值= 1.80E-06）、hsa-miR-182-5p（最小P值= 2.50E-11）、hsa-miR-19b-3p（ 最 小P值= 3.70E-06）、hsa-miR-20a-5p（最小p值= 1.20E-11）高度富集于多個與DNA損傷相關的生物學進程和信號通路中（圖5）。

表1 68個顯著性差異表達miRNAs的倍數變化表格

3 討論

本研究選用抗癌藥物阿霉素誘導肝癌細胞株HepG2 DNA損傷，通過對處理前后HepG2細胞的sRNA進行高通量測序，得到與DNA損傷應答相關的差異表達miRNAs，并分析這些miRNA靶基因參與肝細胞癌DNA損傷應答相關的生物學進程與信號通路的情況。研究發現，miRNA介入多種與DNA損傷以及由DNA損傷誘發的細胞生物過程中，包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等，其在DNA損傷引起的腫瘤生物學進程中發揮重要功能［13，14］。

圖5 miRNA-靶基因參與癌癥相關的生物過程和信號通路熱圖

本研究篩選出具有顯著性差異表達miRNAs 68個，其中表達上調的13個，表達下調的55個。上調miRNAs中hsa-miR-122-5p、hsa-miR-1-3p等參與細胞凋亡、細胞增殖和侵襲等多個與DNA損傷相關的生物進程和信號通路。最新研究表明，在肝癌細胞系HepG2中過表達miR-122可以有效促進肝癌細胞凋亡［15］；Xu等［16］也報道miR-122作為腫瘤抑制因子，通過負調控M2型丙酮酸激酶（PKM2）抑制肝癌細胞生長，這與本實驗阿霉素誘導DNA損傷后激活p53相關信號通路并上調miR-122進而促進肝癌細胞凋亡和抑制肝癌細胞增殖的結果相吻合。另外，miR-1已被證實為腫瘤抑制因子，它通過下調惡性腫瘤發展相關的內皮素1（EF1）從而抑制肝癌細胞的增殖［17］。本實驗中，我們檢測到miR-27a-5p下調，Andrea等［6］發現，原癌基因miR-27a在人肺腺癌細胞A549的DNA損傷反應中起到重要的作用，研究結果表明DNA損傷會引起miR-27a的下調并間接促進miR-27a靶基因——抑癌基因ATM的表達進而抑制肺癌細胞的增殖和生存，本研究與之前的研究一致。我們的結果顯示，miR-17-92基因簇的miR-18a-5p、miR-92a-1-5p、miR-20a-5p和miR-19b-3p 表達均下調。研究表明miR-17-92基因簇是極為重要的致癌基因，在肝癌中高表達［18］。Yan等［19］發現低氧環境導致的DNA損傷會誘導p53過表達進而下調原癌基因miR-17-92表達，抑制細胞的增殖并促進細胞凋亡過程。miR-17-92基因簇具有原癌基因的功能，參與調控細胞周期、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等生理進程，Zhu等［20］通過RT-PCR和原位雜交實驗證實了miR-17-92基因簇在肝癌組織中高表達，阿霉素處理后會激活p53調控的凋亡通路，因此miR-17-92基因簇的下調會有效抑制肝癌細胞的增殖。綜上所述，這些受肝細胞癌DNA損傷影響的差異表達miRNAs在阿霉素誘導的DNA損傷應答進程中起著重要的作用。

4 結論

本研究分析了阿霉素誘導下肝細胞癌細胞系HepG2中miRNA差異表達情況，共檢測出顯著差異表達的miRNA 68條，其中上調13個，下調55個。MiRNA靶基因功能結果顯示，53條miRNAs顯著富集于與DNA損傷應答關聯的生物進程和信號通路中，其中hsa-miR-148a-3p（最小P值= 1.20E-08）、hsa-miR-122-5p（最小P值= 1.80E-06）、hsa-miR-182-5p（最小P值= 2.50E-11）、hsa-miR-19b-3p（最小P值= 3.70E-06）、hsa-miR-20a-5p（最小P值= 1.20E-11）高度富集于多個DNA損傷應答相關的通路中，預示這些miRNA在肝細胞癌HepG2的DNA損傷應答過程中發揮著至關重要的作用。

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（責任編輯 李楠）

Differential Expression Profile Analysis of MicroRNAs in Doxorubicininduced Hepatoma Cell Line HepG2

YANG Ya-lan GUO Zhi-yun DING Ruo-fan MAO Can-quan GUO Jian-xiu XIONG Li-li
（School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031）

The aims of this work are to study the miRNAs of hepatoma cell HepG2 involving in the response to doxorubicin-induced DNA damages，and to analyze the these miRNAs target genes and the biological processes and pathways related to the response to the hepatoma DNA damages. Small RNA sequencing was used to detect the differentially expressed miRNAs between doxorubicin-treated hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and untreated one，and the functions of target genes were analyzed by GO（gene ontology）and KEGG pathway enrichment. Remarkably，68 significantly differentially-expressed miRNAs were identified，13 miRNAs were up-regulated and 55 were down-regulated. After the functional analysis of miRNA targets，the 53 miRNAs were enriched in the biological processes of cell proliferation，cell apoptosis，cell invasion and cell cycle arrest，as well as the pathways of p53 signal，cancer，Wnt signal and MPK，etc. The results demonstrate that these differentially-expressed miRNAs are correlated with DNA damage response-related biological processes and signaling pathways，indicating the prominent importance of these miRNAs in the doxorubicin-induced DNA damage response in hepatocellular carcinoma.

doxorubicin；hepatocellular carcinoma；DNA damage；small RNA sequencing；microRNAs

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.036

2015-12-21

國家自然科學基金資助項目（31200999），中央高校基本科研業務費專項資金資助（2682013BR022）

楊亞藍，女，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：lynneyyl@126.com

熊莉麗，女，博士，講師，研究方向：非編碼RNA結構與功能；E-mail：xllllx@yeah.net