EMS誘變和NaCl脅迫的正交實驗及耐鹽纖維亞麻種質的篩選

王衛國 鄧倩 計巧靈 王偉

（新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046）

EMS誘變和NaCl脅迫的正交實驗及耐鹽纖維亞麻種質的篩選

王衛國 鄧倩 計巧靈 王偉

（新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046）

旨為經愈傷組織誘導再生的耐鹽性纖維亞麻植株奠定基礎。以3種纖維亞麻無菌苗的下胚軸段為材，經EMS誘變和鹽脅迫的正交實驗，再經誘芽和愈傷組織培養，研究其理化特性。結果顯示，‘范妮’、‘天鑫3號’和‘雙亞5號’下胚軸段不定芽培養的最適處理組合均為0.025% EMS處理2 h（或4 h），之后用100或150 mmol/L NaCl處理12 h；總產芽率由高到低分別為‘范妮’、‘天鑫3號’和‘雙亞5號’下胚軸段；對3種亞麻不定芽生長影響的順序為：NaCl濃度＞EMS濃度＞EMS處理時間；3種亞麻下胚軸段不定芽誘導的適宜培養基為MS + 0.000 2 mg/L TDZ + 0.02 mg/L KT + 0.005 mg/L NAA + 0.3%蔗糖+ 0.1 g/L肌醇+ 3.3 g/L植物凝膠。經0.025% EMS處理4 h + 150 mmol/L NaCl處理12 h后生長的愈傷組織，經過2次交替篩選后，其理化指標表明，與對照組的相比，3種亞麻處理組愈傷組織脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量、SOD和POD活性均顯著提高（P<0.05）。經過0.025% EMS處理4 h+150 mmol/L NaCl處理12 h后生長的愈傷組織具有一定的耐鹽性。

纖維亞麻；EMS誘變；鹽脅迫；正交實驗；理化特性

進入21世紀以來，全球對麻織品的需求量每年以15%-20%的速度遞增［1］。而麻類是我國的傳統特色作物，近年纖維亞麻在我國的種植面積和加工能力已位居世界第二［2-4］，但多年來，亞麻原料缺口巨大，每年50%以上的原料需要進口［1］。為了解決麻纖維總量不足、優質率低等難題，國內科學工作者們將傳統育種與現代育種手段結合，篩選配合力高且性狀優良的親本，輔之以分子標記輔助育種、外源基因導入等技術，培育出多種亞麻新品種，使原莖產量、出麻率、長麻率、株高等性狀有了較大改善［4，5］，但我國是糧食大國，種麻不能與種糧爭地。那么，能否利用大片的中、低度鹽漬土地種植亞麻就成為科學工作者們苦苦思索的問題。新疆是繼黑龍江之后的國內第二大纖維亞麻產區［6］，也是中國鹽漬土分布最廣、面積最大的省區，目前新疆的纖維亞麻主要靠引種在北疆的伊犁、塔城、昌吉等地的糧田種植。因此，迫切需要通過多種技術盡快培育耐鹽、耐旱且質優的纖維亞麻新品系，以適應在新疆廣袤的中、低度鹽漬化土壤和干旱氣候下生長，在不與種糧爭地的情況下快速發展纖維亞麻業。

關于纖維亞麻耐鹽育種方面國外研究較早［7，8］，1984年McHughen通過組培技術就獲得McGregor栽培變種的耐鹽細胞系，1987年獲得再生植株，并在其后代中通過多項指標篩選到耐鹽植株。國內近年這方面研究只有些初步報道［9-15］，趙東升［9，10］對200個亞麻品種種子進行鹽堿脅迫，從中選出了11份耐性較好的品系，并以耐鹽堿與不耐鹽堿品系為材，用分子生物學技術尋找兩者的特異性，為后續亞麻耐鹽堿分子輔助育種奠定基礎。郭媛等［11］通過對纖用和油用的10個亞麻品種種子進行鹽堿脅迫的發芽實驗，認為油用品種的耐性均強于纖用品種的。王紅梅等［12］研究了鹽脅迫下3個亞麻品種幼苗的理化指標，認為Ariane品種的抗鹽性較高。本實驗室的研究生葛春輝、李文婷、王偉等對新疆主栽的多個亞麻品種的耐鹽性做了大量前期研究工作［13-15］。因此，本研究在前人研究的基礎上預運用組織培養加誘變加鹽脅迫的技術獲得多個變異的亞麻耐鹽種質，旨為經愈傷組織誘導再生的耐鹽性纖維亞麻植株研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

研究以新疆主栽的3個纖維亞麻品種為材料，‘范妮’種子由中科院麻類研究所于2011年饋贈；‘天鑫3號’種子由新疆農科院經濟作物研究所于2011年饋贈；‘雙亞5號’種子由新疆農科院經濟作物研究所于2008年饋贈。種子用10%過氧化氫滅菌10 min，之后不經無菌水洗，直接接入種子萌發培養基（MS基本固體培養基，無生長調節劑）。培養條件：室溫為（23±2）℃，光照周期16 h/d，光照強度為1 500-2 500 lx。培養8 d后，在凈化臺上將下胚軸切成0.5-0.9 cm長的小段，用于EMS（甲基磺酸乙酯）誘變和鹽脅迫的正交實驗。

1.2 方法

1.2.1 正交實驗 根據前期探索的3種纖維亞麻下胚軸段經不同濃度EMS處理不同時間后的成活率、出愈率和出芽率，設定了EMS濃度、處理時間和NaCl濃度的4個水平（表1），各處理鹽脅迫均為12 h。之后接種在不同的誘導培養基上（根據前期實驗篩選出的較合適的誘芽培養基），在上述培養條件下生長，培養25 d后記錄實驗結果，以3個品種的胚軸段出芽率為指標，確定最適合的EMS濃度、時間和鹽處理的組合。

表1 L16（45）正交實驗的因素與水平

1.2.2 愈傷組織的耐鹽性檢測和耐鹽種質的篩選 選擇適宜培養基進行愈傷組織的繼代和不定芽的擴增，將正交實驗中最適組合處理以及最佳培養基上所得的愈傷組織經過30 d培養后，分別轉入與正交實驗鹽濃度相同的含鹽固體培養基上培養25 d，之后再轉入不含鹽的相同固體培養基上擴增（以正常同期培養的愈傷組織為對照），再繼代3次（每次30 d）后，以擴增的愈傷組織為材料進行以下幾項生理生化指標檢測。根據侯福林［16］的方法測定脯氨酸的含量。根據張志良［17］的方法測定可溶性糖的含量。根據鄒琦［18］的方法測定可溶性蛋白的含量、SOD（超氧化物歧化酶）酶活、POD（過氧化物酶）酶活。以上實驗均以未處理的3種亞麻下胚軸段生長分化的愈傷組織作為對照。

1.2.3 數據分析 SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析，比較差異顯著性。

表2 纖維亞麻‘范妮’下胚軸段正交實驗結果

2 結果

2.1 三種不同亞麻下胚軸段正交實驗結果

纖維亞麻‘范妮’下胚軸段正交實驗結果（表2）顯示，在3個因素中影響‘范妮’下胚軸段不定芽出芽率由大到小的順序為NaCl濃度> EMS濃度> EMS處理時間。結果表明，‘范妮’下胚軸段不定芽培養的最佳因素水平為A1B2C2，即0.025% EMS處理胚軸段4 h，之后用150 mmol/L NaCl處理胚軸段12 h，在此組合處理后，‘范妮’下胚軸段產芽量較多，且芽形態較好。

纖維亞麻‘天鑫3號’下胚軸段正交實驗結果（表3）顯示，在3個因素中，影響‘天鑫3號’下胚軸段不定芽出芽率由大到小的順序也是NaCl濃度> EMS濃度> EMS處理時間，這與‘范妮’下胚軸段的相同。正交實驗結果表明，‘天鑫3號’下胚軸段不定芽培養的最佳處理組合為A1B1C1或A1B2C2，即0.025% EMS處理2 h（或4 h），之后用100或150 mmol/L NaCl處理12 h，這與‘范妮’最佳組合相似，但出芽率的總平均數低于‘范妮’。

纖維亞麻‘雙亞5號’下胚軸段正交實驗結果（表4）顯示，在3個因素中，影響纖維亞麻‘雙亞5號’下胚軸段不定芽出芽率由大到小的順序，也為NaCl濃度> EMS濃度> EMS處理時間，這與探究3種因素對‘范妮’和‘天鑫3號’的影響結果相同。正交實驗結果表明，‘雙亞5號’下胚軸段不定芽培養的最佳處理組合為A1B1C1或是A1B2C2，即0.025% EMS處理2 h（或4 h），之后用100 mmol/L（或150 mmol/L）NaCl處理12 h。經過處理后的‘雙亞5號’平均出芽率為44.5%，低于‘范妮’和‘天鑫3號’的。

表3 纖維亞麻‘天鑫3號’下胚軸段正交實驗結果

由以上所得結果可知，經處理后3種纖維亞麻下胚軸段出芽率均在組合0.025% EMS+2 h或4 h +100或150 mmol/L NaCl中為最佳。

2.2 三種亞麻下胚軸段在不同誘芽培養基上出芽和出愈情況

在同時考慮到處理的作用和可比性后，選擇經0.025% EMS處理4 h，之后經150 mmol/L NaCl處理12 h的下胚軸段長出的不定芽和愈傷組織進行擴增。統計相同處理后的3種亞麻下胚軸段在不同誘芽培養基上的出芽和芽生長情況，結果如表5所示。

由表5可見，‘范妮’下胚軸段在2號培養基上長出的不定芽最多，但芽很小時就玻璃化，不能生長；在3號培養基上長出的芽白化現象嚴重，基本不能生長；在5號培養基上雖然產生的不定芽較少，但多數形態較正常，能生長，只是生長較慢，說明低濃度的TDZ結合低濃度KT和NAA對正常不定芽的分化有效，這與Bretagne［19］在研究纖維亞麻品種‘Ariane’和‘Viking’下胚軸離體萌芽以及Jain等［20］研究亞麻品種‘Neelam’下胚軸產生不定芽時使用的最佳TDZ濃度相差甚遠，僅為其用量的1/10。‘天鑫3號’和‘雙亞5號’下胚軸段的誘芽情況與‘范妮’下胚軸段的相似，只是出芽率略低一些。

從產生愈傷組織情況來看，在2、3和5號培養基上，3個亞麻品種的下胚軸段產生的愈傷組織量較多，質地稍軟，特別是在3號培養基上，3個亞麻品種的下胚軸段產生的愈傷組織質地較好，生長較快。

2.3 三種亞麻愈傷組織的耐鹽性

由于經過上述鹽脅迫和擴增后產生的不定芽數量太少，而愈傷組織量較多，對相同處理（0.025%EMS 處理4 h，之后經150 mmol/L NaCl處理12 h）后的3種亞麻下胚軸段產生并擴增的愈傷組織進行了耐鹽性鑒定。

表4 纖維亞麻‘雙亞5號’下胚軸段正交實驗結果

表5 不同誘芽培養基上3種纖維亞麻下胚軸段萌芽情況

2.3.1 三種亞麻愈傷組織中脯氨酸含量的變化 3種亞麻經相同的處理后生長的愈傷組織，經過含鹽培養基與不含鹽培養基交替培養，測定了所得的愈傷組織與對照組的愈傷組織內的脯氮酸含量，比較結果可以看出，3種亞麻各自本身脯氨酸含量有差異，但它們的處理組愈傷組織中脯氨酸含量均高于對照組（圖1），‘范妮’脯氨酸含量處理組比對照組提高了2倍多，由對照組的1.18 mg/g提高到了處理組的2.78 mg/g；‘天鑫3號’的脯氨酸含量也由0.58 mg/g提高到0.99 mg/g，提高了1.7倍；‘雙亞5號’的脯氨酸含量由0.78 mg/g提高到了2.01 mg/g，也提高了2倍；SPSS軟件分析表明，3種亞麻處理組愈傷組織的脯氨酸含量均顯著高于對照組（P<0.05），其中‘范妮’的差異最大。

圖1 對照組與處理組愈傷組織中脯氨酸含量

2.3.2 三種亞麻愈傷組織中可溶性糖含量的變化 3種亞麻處理組可溶性糖含量均比對照組有所提高，其中‘天鑫3號’處理組的可溶性糖含量最高（圖2）。‘范妮’由33.63 mg/g提高到88.52 mg/g；‘天鑫3號’可溶性糖含量由36.75 mg/g提高到98.31 mg/g；‘雙亞5號’可溶性糖含量由30.39 mg/g提高到74.15 mg/g。經SPSS軟件分析，3種亞麻處理組愈傷組織可溶性糖含量均顯著高于對照組的（P<0.05）。

2.3.3 三種亞麻愈傷組織中可溶性蛋白含量的變化 3種亞麻處理組愈傷組織的可溶性蛋白含量均比對照組有所提高，其中‘天鑫3號’可溶性蛋白含量最高（圖3）。范妮由對照組的57.09 mg/g提高到了處理組的94.25 mg/g；‘天鑫3號’可溶性糖含量由50.55 mg/g提高到100.4 mg/g；‘雙亞5號’的可溶性糖含量由46.35 mg/g提高到了88.70 mg/g。經SPSS軟件分析顯示，3種亞麻處理組愈傷組織可溶性蛋白含量均顯著高于對照組（P<0.05）。

圖2 對照組與處理組愈傷組織中可溶性糖含量

圖3 對照組愈傷與處理組愈傷可溶性蛋白含量

圖4 對照組與處理組愈傷組織中SOD活性

2.3.4 三種亞麻愈傷組織中SOD活性的變化 3種亞麻的處理組愈傷組織的SOD活性均比對照組有所提高，其中‘天鑫3號’SOD活性最高（圖4）。范妮由對照組的87.22 U/（g·min）提高到處理組的155.88 U/（g·min）；‘天鑫3號’SOD活性由78.18 U/（g·min）提高到161.7 U/（g·min）；‘雙亞5號’的SOD活性由80.63 U/（g·min）提高到了141.51 U/（g·min）。經SPSS軟件分析表明，3種亞麻愈傷組織處理組SOD活性均顯著高于對照組的（P<0.05）。

2.3.5 三種亞麻愈傷組織中POD活性的變化 3種亞麻的處理組愈傷組織的POD活性均比對照組的有所提高，其中‘天鑫3號’ POD活性最高（圖5）。‘天鑫3號’POD活性由44.87 U/（g·min）提高到92.44 U/（g·min）；‘范妮’由對照組的46.25 U/（g·min）提高到了處理組的82.88 U/（g·min）；‘雙亞5號’的POD活性由49.27 U/（g·min）提高到了87.91 U/（g·min）。經SPSS軟件分析表明，3種亞麻處理組愈傷組織POD活性與對照組的相比均存在顯著性差異（P<0.05）。

圖5 對照組與處理組愈傷組織中POD活性

經上述生化、生理指標的檢測，可以確定處理組中3種亞麻處理組愈傷組織與對照組愈傷組織相比較，脯氨酸含量、可溶性糖、可溶性蛋白、SOD活性、POD活性都有顯著性提高。目前已證實，植物在逆境條件下會大量積累脯氨酸作為滲透調節物質，因此脯氨酸含量與植物的抗逆性之間呈明顯的正相關的關系，SOD和POD都是植物中重要的保護酶，可防御氧自由基對細胞膜系統的傷害，因此纖維亞麻愈傷組織內SOD和POD活性升高，無疑會提高其耐鹽性。本研究的結果表明，3種纖維亞麻經最佳處理組合處理后得到的愈傷組織在生理上有較強的抗鹽性。

3 討論

葛春輝等［13］通過組織培養加鹽脅迫技術獲得‘雙亞5號’耐鹽愈傷組織，但基本不再生芽。李文婷等［14］探討了‘雙亞5號’和‘范妮’幼苗對鹽脅迫的生理反應，認為‘范尼’幼苗比‘雙亞5號’幼苗更具耐鹽潛力。之后中國農科院亞麻所提供了幾個新品系，擴大了比較的范圍，王偉等［15］探索了‘雙亞5號’、‘范妮’、YOI254、YOI303、‘天鑫3號’和HIZ019纖維亞麻幼苗對鹽脅迫的生理反應，認為YOI254、‘天鑫3號’和HIZ019幼苗的耐鹽性較好。由于‘范妮’、‘天鑫3號’和‘雙亞5號’仍是目前新疆主栽的纖維亞麻品種，且我們已對它們的組培條件、幼苗耐鹽的生理生化反應有了一些了解，所以本研究仍以這3個品種為實驗材料。在設計3因素（EMS濃度、EMS處理時間及NaCl濃度）4水平之前，我們已反復探索了3因素單個或組合的多個水平，發現與其它作物相比，亞麻對EMS濃度很敏感，但這種敏感不是在20-30 d中就可顯現，往往是1-2個月后突然整瓶的死亡，無法控制，所以我們選用的EMS濃度較低，要保證至少有近1/3的材料是存活的，這樣再經過鹽脅迫，才有可能篩選到活的材料。這3種亞麻對NaCl濃度較敏感，濃度高時死亡率過高，因此，設計的鹽濃度也較低。在本研究之前，我們已探明了這3種亞麻下胚軸段不經誘變和鹽脅迫條件下的出芽和芽生長的最佳培養基配比和培養條件，還得到了少量試管苗，但經過誘變和鹽脅迫的正交實驗后，下胚軸段在這些培養基上的出芽率大大降低，且芽生長狀況也不太理想，玻璃化、白化、畸形葉較多，多數芽生長緩慢，這些問題還需要深入細致地摸索。

4 結論

筆者通過正交實驗探究了EMS濃度、EMS處理時間及NaCl濃度3因素4水平對3種亞麻下胚軸段不定芽和愈傷組織產生和生長的影響，確定了其中最佳的處理組合：0.025% EMS+4 h+150 mmol/L NaCl。對3種亞麻不定芽產生和生長影響的順序為：NaCl濃度＞EMS濃度＞EMS處理時間；3種亞麻下胚軸段不定芽誘導的適宜培養基為：MS+ 0.000 2 mg/L TDZ+ 0.02 mg/L KT+ 0.005 mg/L NAA+0.3%蔗糖+0.1 g/L肌醇+3.3 g/L植物凝膠。經0.025% EMS+4 h+150 mmol/L NaCl處理12 h后生長的愈傷組織，經過含鹽-無鹽兩次交替篩選后，測定其生理生化指標，結果表明：處理組愈傷組織與對照組相比，脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性均有顯著提高（P<0.05），其中，‘范妮’愈傷組織中脯氨酸含量增長倍數稍高于‘天鑫3號’和‘雙亞5號’；3種亞麻處理組愈傷組織中可溶性糖增長倍數相近；從可溶性蛋白含量、SOD和POD活性的增長倍數上看，‘天鑫3號’均高于其他2種纖維亞麻愈傷組織的。表明經過0.025%EMS+4 h+150 mmol/L NaCl處理12 h后生長的愈傷組織具有一定的耐鹽性。

［1］熊和平. 我國麻類生產的現狀與政策建議［J］. 中國麻業科學, 2010, 32（6）：301-305.

［2］呂江南, 賀德意, 王朝云, 等. 全國麻類生產調查報告［J］. 中國麻業, 2004, 26（2）：95-102.

［3］王玉富. 我國亞麻生物技術的研究現狀及發展［J］. 中國麻業, 2005, 27（2）：60-65.

［4］粟建光, 揭雨成, 龔友才, 等. 麻類優異種質的創新與利用研究［J］. 中國麻業, 2004, 26（2）：56-59.

［5］ 康慶華, 關鳳芝, 王玉富, 等. 中國亞麻分子育種研究進展［J］.中國農業科學, 2006, 39（12）：2428-2434.

［6］吳廣文. 我國纖維亞麻行業發展綜述［J］. 中國麻業科學, 2007, 29（2）：64-66.

［7］McHughen A, Swartz M. A tissue culture derived salt-tolerant line of flax（Linum usitatissimum）［J］. J Plant Physiol, 1984, 117：109-117.

［8］McHughen A. Salt tolerance through increased vigor in a flax line（STS-II）selected for salt tolerance in vitro［J］. Theoretical and Applied Genetics, 1987, 74（6）：727-732.

［9］趙東升. 亞麻耐鹽堿品種篩選的研究［J］. 黑龍江農業科學, 2011（7）：12-13.

［10］趙東升. 亞麻耐鹽堿ISSR標記引物篩選的研究［J］. 黑龍江農業科學, 2013（8）：12-13.

［11］郭媛, 邱財生, 龍松華, 等. 鹽堿脅迫對不同地區亞麻主栽品種種子萌發的影響［J］. 種子, 2013, 32（12）：1-5.

［12］王紅梅, 金忠民, 孫雪巍, 等. 鹽脅迫對亞麻幼苗生長的影響［J］. 齊齊哈爾大學學報, 2005, 21（4）：87-89.

［13］葛春輝, 計巧靈, 王雪華, 等. 亞麻耐鹽性愈傷組織的生理生化特性［J］. 植物研究, 2008, 28（5）：603-607.

［14］李文婷, 姜麗, 計巧靈, 等. 鹽脅迫下兩個亞麻品種幼苗的生理生化特性［J］. 生物技術, 2009, 19（2）：26-29.

［15］王偉, 鄧倩, 計巧靈. NaCl脅迫對6種纖維亞麻幼苗生化特性的影響［J］. 中國農學通報, 2013, 29（18）：84-88.

［16］侯福林. 植物生理學實驗教程［M］. 北京：科學出版社出版, 2000：2311-2314.

［17］張志良, 翟偉菁. 植物生理學實驗指導［M］. 北京：高等教育出版社, 2005：39-41.

［18］鄒琦. 植物生理學實驗指導［M］. 北京：中國農業出版社, 2000：2428-2434.

［19］Bretagne B, Chupeau MC, Chupeau Y, et al. Improved flax regeneration from hypocotyls using thidiazuron as a cytokinin source［J］. Plant Cell Reports, 1994, 14：120-124.

［20］Jain P, Rashid A. Stimulation of shoot regeneration on Linum hypocotyl segments by thidinzuron and its response to light and calcium［J］. Biologia Plantarum, 2001, 44（4）：611-613.

（責任編輯 馬鑫）

Orthogonal Test of EMS Mutation and NaCl Stress and Screening of Salt-tolerant Fiber Flax Germplasm in Vitro

WANG Wei-guo DENG Qian JI Qiao-ling WANG Wei
（College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work aims to lay the primary foundation for breeding salt-tolerant fiber flax plant induced from the callus. The hypocotyl segments from sterile seedlings of 3 kinds of fiber flax were treated in the orthogonal test with EMS induction and salt stress，and cultured through bud and callus induction. Further，the physicochemical characteristics of the buds and callus were explored. The optimal treatment combination for adventitious buds derived from “Fanny”，“Tianxin 3” and “Shuangya 5” all were 0.025% EMS for 2 h or 4 h，and then 150 mmol/L NaCl for 12 h. Total bud yield from high to low were the hypocotyls segments of “Fanny”，“Tianxin 3” and “Shuangya 5”. The order of factors affecting the emergence and growth of the adventitious buds was concentration of NaCl＞concentration of EMS＞treating time with EMS. The optimal medium for the induction of adventitious buds from 3 species fiber flaxes was MS+0.000 2 mg/L TDZ+0.02 mg/L KT+0.005 mg/L NAA+0.3% sucrose+0.1 g/L inositol+3.3 g/L phytogel. The callus was treated with 0.025% EMS for 4 h then 150 mmol/L NaCl for 12 h and screened through salt and salt-free medium twice alternately，and the physicochemical properties of which were determined. The results showed that proline content，soluble sugar content，soluble protein，SOD activity and POD activity in the callus of treated group of 3 species fiber flax all increased remarkably（P<0.05）compared with their control group. Conclusively，the callus of treated group with 0.025% EMS for 4 h then 150 mmol/L NaCl for 12 h possessed solid salt tolerance.

fiber flax；EMS mutation；NaCl stress；orthogonal test；physicochemical property

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.015

2015-08-03

國家自然科學基金項目（31160295）

王衛國，男，助理研究員，研究方向：植物細胞工程；E-mail：2240658411@qq.com

計巧靈，女，教授，研究方向：植物生物技術；E-mail：wji1118@163.com