牙鲆emx1基因的克隆及表達

孫文慧 張俊玲 施志儀 孫近近 向玉婷 陳曉武

（上海海洋大學水產與生命學院 農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306）

牙鲆emx1基因的克隆及表達

孫文慧 張俊玲 施志儀 孫近近 向玉婷 陳曉武

（上海海洋大學水產與生命學院 農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306）

為闡述空通氣孔同源框1（empty spiracles homeobox 1，emx1）基因在牙鲆發育中的作用，通過PCR技術克隆牙鲆emx1基因，運用BioEdit、MEGA等軟件分析其序列結構特征，并采用熒光定量PCR技術分析其在牙鲆早期發育和組織分布中的表達情況。結果成功獲得一長度為1 127 bp的牙鲆emx1 cDNA序列，其中包括708 bp的開放閱讀框，編碼235個氨基酸。同源性比對發現，牙鲆emx1基因的氨基酸序列與雀鯛和花鳉同源性最高，為95%，與其它物種如斑馬魚、墨西哥脂鯉、原雞、熱帶爪蟾、小鼠和人的同源性分別為87%、84%、83%、80%、72%和72%。系統進化樹分析顯示，牙鲆Emx1蛋白與魚類Emx1緊密聚為一支。熒光定量 PCR顯示，emx1基因在牙鲆卵巢中的表達量豐富，精巢中次之，而在其他各組織的表達量則較低。emx1在從原腸胚到孵化后10 d的牙鲆早期發育中也發現了相對較高的表達，且在胚孔封閉和心跳期有最高的表達。結果表明emx1基因很可能在牙鲆早期發育和生殖系統中發揮重要作用。

空通氣孔同源框1（emx1）；牙鲆；cDNA克隆；基因表達

空通氣孔同源框（empty spiracleshomeobox，emx）是人類與果蠅ems（empty spiracles）的同源結構域基因，含同源轉錄因子，在果蠅頭部的早期發育中發揮重要作用［1，2］。脊椎動物emx包括emx1和emx2，位于同源盒基因（homeotic genes，hox）家族的外側，在脊椎動物發育中的大腦表達并對端腦背側、大腦皮層和中樞神經系統發育起關鍵作用［3，4］。在小鼠的成熟發育中，二者的表達時間與分布非常相似，但并不完全同步。例如，Emx2主要表達在端腦的背側、間腦的背側和前側，而Emx1僅在端腦背側表達。在小鼠胚胎中Emx2在8.5日齡就可以檢測到，而Emx1在9.5日齡的胚胎中才可以檢測到［5-8］。近年研究發現，哺乳動物Emx2基因在發育中的泌尿生殖系統以及能形成排泄器官和生殖系統的原基細胞中也有表達，并呈生殖周期性變化［9，10］；且在子宮內膜上皮細胞中是一種必不可少的增殖抑制基因［11］。缺乏Emx2可使小鼠患特納綜合癥即性腺發育不完全［12］。這些研究表明emx2在泌尿生殖系統的發育和分化過程發揮重要作用，而對于emx1的研究目前僅限于大腦皮層及神經系統，對生殖中的作用研究甚少。

牙鲆是一種重要的海水經濟魚類，雌性個體明顯大于雄性個體［13］，有關牙鲆性別決定和生殖調控的分子調控機制研究備受重視。我們先前的研究鑒定了牙鲆emx2基因并對其在牙鲆中的表達進行了研究，發現emx2基因在牙鲆神經胚時期表達量最高，而在隨后的胚胎發育期和早期仔魚中表達水平逐漸降低，同時其在牙鲆成魚的腦、性腺包括卵巢和精巢中均有表達，尤其在卵巢中的表達量最高［14］，表明emx2基因不僅在魚類神經系統中發揮作用，也可能在魚類生殖中起重要作用。因此，本研究進一步克隆牙鲆emx1基因，并分析其分子特性及在牙鲆各組織和早期發育中的表達模式，以期為闡述emx基因在牙鲆生殖調控中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚 牙鲆成魚采集于中國水產科學研究院黃海水產研究所，隨機選取6條成魚（雌雄各3條）進行解剖取組織，包括腦、鰓、肝臟、腎臟、卵巢、精巢、心臟、肌肉、胃、腸，DEPC水沖洗干凈后在液氮中速凍，然后置于-80℃保存備用［15］。牙鲆胚胎和仔魚采集于中國水產科學研究院北戴河中心實驗站，在（16±1）℃的過濾海水中孵化和飼養，分別采集未受精卵（0 h）、受精卵（0.5 h）、囊胚期（9 h）、原腸胚期（26 h）、神經胚期（42.5 h）、胚孔封閉期（48 h）、心跳期（71 h）、出膜前（75 h）及剛出膜（78.5 h）、孵化后3、7、9、10、14、17、20、23、29、36 和41 d 仔魚，各期樣品平行取樣3組，每組15-30個體［16］。

1.1.2 菌株和質粒 pMD?19-T Vector購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α均由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 Trizol Reagent試劑盒購自Invitrogen公司；DNase I、RNase Inhibitor、M-MLV Rtase等反轉錄試劑購自Promega公司；Gel Extraction Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；2×iQTM SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉錄 將上述各牙鲆樣品依照Trizol Reagent試劑盒方法提取總RNA。總RNA用Agilent 2100 Bioanalyzer測定OD260/OD280值及濃度，P值均在1.8-2.0之間。用2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，確認28S和18S條帶清晰，無RNA降解，RNA質量能夠滿足后續實驗要求，置于-80℃保存備用。

所得總RNA用DNase I 處理后，按以下體系進行反轉錄：在除酶離心管中加入1 000 ng總RNA，1 μL OligodT Primer（50 μmol/L），補充DEPC處理的ddH2O至10 μL，70℃放置10 min后立即置于冰上5 min；然后加入以下試劑：5×M-MLV buffer 5 μL，RNase Inhibitor（25 U）1 μL，M-MLV Rtase（200 U/μL）1 μL，dNTP mixture（10 μmol/L）1 μL，補充DEPC處理的ddH2O至20 μL；在PCR儀上進行反轉錄，反應條件為：42℃ 60 min，75℃ 15 min。反轉錄后的cDNA置于-20℃保存。

1.2.2 牙鲆emx1的克隆 查詢本實驗室先前高通量測序的牙鲆轉錄組文庫，檢索到一牙鲆emx1基因的EST序列，根據該EST序列設計基因特異性引物emx1-F和emx1-R（表1），用牙鲆各組織混合的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸72 s，共36個循環；72℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用Gel Extraction Kit 純化回收目的條帶。將純化產物連接到pMD?19-T Vector上，16℃連接過夜后，轉化到大腸桿菌DH5α菌株中，經藍白斑篩選，挑選陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 序列和進化樹分析 用ORF Finder（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預測牙鲆emx1可能的開放閱讀框，并推測編碼的氨基酸序列。用BioEdit軟件將得到的牙鲆Emx1蛋白序列和GenBank數據庫中其他生物同源蛋白的氨基酸序列進行比對分析。運用MEGA 5.2軟件，采用NJ（Neighbor-Joining）法構建進化樹。其他脊椎動物的EMX1氨基酸序列均從NCBI中GenBank下載，登錄號如下：雀鯛（Stegastes partitus）（XP_008277178）；斑馬魚（Danio rerio）（NP_937787.1）；半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）（XP_008314554.1）；花 鳉（Poecilia formosa）（XP_007569597.1）；海龜（Chelonia mydas）（XP_007072072.1）；羅非魚（Oreochromis niloticus）（XM_003447768.2）； 牛（Bos taurus）（NP_001179152.1）；原雞（Gallus gallus）（XP_001-232151.2）；墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）（XP_ 007236486.1）；熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）（NP_ 001005459.1）；智人（Homo sapiens）（NP_004088.2）；小鼠（Mus musculus）（NP_034261.1）。

1.2.4 定量PCR 設計高效特異的引物（表1），在CFX96TouchTMReal-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）上進行定量檢測。首先制備目的基因和內參基因（18S）的標準曲線。20 μL的反應體系包括了1 μL cDNA（從100 ng-0.1 ng，10倍梯度稀釋），0.4 μL的特異性引物（qemx1-F和qemx1-R），10 μL的 2×iQTM SYBR Green Supermix和 8.2 μL的ddH2O。反應條件為：95℃ 1 min；95℃ 10 s，61℃15 s，并隨之采集熒光40次，然后進行熔解曲線的擴增。標準曲線結果顯示目的基因和內參基因的R值均大于0.99，相應的擴增效率（E）均介于95%-100%之間。隨后對所有樣品進行定量檢測，PCR反應體系和條件同上，實驗設3個重復。

1.2.5 統計分析 牙鲆emx1 mRNA的表達水平采用2-ΔΔCt法計算，其數值用平均值±標準誤（x-±s）表示，n=3。牙鲆各發育時期以未受精卵中的相對mRNA 量為對照，牙鲆不同組織以肝臟中的相對mRNA量為對照。統計分析采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析（one-way ANOVA），使用Dunnett's T3 test進行比較，當P<0.05時表示差異顯著。

表1 用于PCR擴增的引物序列

2 結果

2.1 牙鲆emx1的克隆及結構分析

以牙鲆總RNA為模板，通過PCR克隆得到一段長1 127 bp的cDNA序列，與目的序列大小一致。經生物信息學分析，該序列包括長708 bp的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼235個氨基酸，含278 bp的3'非翻譯區（3' untranslated region，3'-UTR）和141 bp的5'-UTR（圖1）。編碼的蛋白質分子量和等電點分別為26.9 kD和9.74。ORF區的135-195個氨基酸是一個保守的同源蛋白結構域。在3'-UTR區，發現2個mRNA快速降解信號（ATTTA）和1個聚腺苷酸化信號（ATTAA）。

2.2 牙鲆與其他物種之間emx1序列比對及進化樹構建

通過多物種的emx1氨基酸序列比較（圖2）顯示，牙鲆Emx1蛋白與雀鯛和花鱂的同源性最高，均為95%；其次是羅非魚（90%）、斑馬魚（87%）、墨西哥脂鯉（84%）、半滑舌鰨（79%），而與兩棲動物熱帶爪蟾同源性為80%，與爬行動物海龜的同源性為81%，與哺乳動物人、小鼠、牛的同源性也較高，分別為72%、72%和73%。同時，Emx1同源結構域在脊椎動物中是高度保守的，且在所有魚類中達到100%一致性。經 NJ 系統進化樹分析，牙鲆Emx1與所有魚類聚為一支（圖3）。

圖1 牙鲆emx1 cDNA序列及推導出的氨基酸序列

圖2 牙鲆emx1與其他物種的氨基酸序列比對

2.3 牙鲆emx1在早期發育和成體組織中的表達

定量PCR結果（圖4）顯示，emx1基因在牙鲆早期發育的各個階段均有表達，并且多個發育時間點差異表達顯著（P<0.05）。在未受精卵、受精卵、囊胚期emx1表達量很低，在原腸胚、神經胚期逐漸升高，而在胚孔封閉和心跳期達到頂峰，在出膜和出膜后其表達逐漸降低，但直至孵化后10 d仍保持較高的表達水平；而在孵化后14-41 d的仔魚中降至很低的水平。

圖3 基于NJ法構建的emx1氨基酸序列系統進化樹

圖4 牙鲆emx1在早期發育中的相對表達

圖5顯示，牙鲆emx1基因在所檢測的組織中廣泛表達，并且不同組織中的表達差異顯著（P<0.05）。emx1基因在卵巢中表達最高，約為肝臟中的97倍（P<0.01）；其次，emx1在精巢中也有較高的表達，而在包括腦在內的其他各組織中的表達均較低。

圖5 牙鲆emx1在成體組織中的相對表達

3 討論

本研究克隆得到了牙鲆emx1基因的cDNA序列并分析了其序列特征。系統進化和氨基酸同源比對分析都表明牙鲆emx1基因與脊椎動物各物種均具有較高的同源性（72%-95%），且與其他脊椎動物一樣，在牙鲆emx1基因中有一個高度保守的同源結構域，該同源保守域在牙鲆和其他硬骨魚類保持100%一致。這說明emx1在脊椎動物的系統進化過程中是高度保守的。研究發現，該同源域參與調控眾多基因的表達，通過影響大腦皮層神經纖維的發育和成熟來調控神經系統的發育［17］，同時也是生殖系統重要的增殖抑制因子［18，19］。

在牙鲆早期發育中，emx1基因從神經胚期開始表達量急劇升高，在胚孔封閉和心跳期達到最高水平，而在隨后的胚胎期和孵化后仔魚中其表達量逐漸降低。從神經胚期開始的早期發育階段是魚類神經系統產生、發育和完善的重要時期，此時emx1基因的高表達表明其與其他脊椎動物emx1基因一樣，可能在神經系統的發育中具有重要作用。有較多的研究已表明，Emx1基因在哺乳動物發育中的大腦中大量表達［4，5，20-22］，Emx1和Emx2雙重缺失的小鼠大腦皮層會造成早期發育模式的缺陷，如海馬體和齒狀回缺失，嗅球增長和紋理缺陷［23-25］。此外，與牙鲆emx2在神經胚期即達到最高表達水平［14］相比，牙鲆emx1的表達要相對滯后，在胚孔封閉和心跳期才出現表達高峰，這與Simeone等［4］發現Emx2比Emx1在小鼠胚胎中的表達要更早更快的結果是一致的。

在牙鲆組織分布上，emx1基因與先前鑒定的牙鲆emx2［14］相似，二者均在成體性腺中比在腦中具有更為豐富的表達，且在卵巢中的表達量高于精巢。Pellegrini等［26］和Miyamoto等［27］報道，Emx2基因在哺乳動物尤其是小鼠性腺包括精巢和卵巢中均有表達，且在卵巢中表達水平相對偏高。研究表明Emx2對哺乳動物的泌尿生殖系統有重要影響，在敲除Emx2的小鼠中，腎臟、輸尿管、性腺和生殖道完全消失，而腎上腺和膀胱正常發育［28］，Emx2通過改變子宮內膜細胞的增殖以調控哺乳動物生殖，組成型Emx2表達量升高會導致平均著床率下降40%［29］。目前有關Emx1基因表達的報道主要集中在哺乳動物的神經系統和泌尿系統相關的組織中［30］，而缺乏關于其在脊椎動物性腺中的表達及在生殖系統中的功能研究，本研究結果提示emx1基因在魚類生殖中可能發揮著重要作用。

4 結論

本研究克隆了牙鲆emx1 cDNA序列，并利用定量PCR技術檢測了其在牙鲆早期不同發育階段和成魚不同組織中的表達，結果表明emx1在牙鲆早期的胚孔封閉期、心跳期及成體卵巢中表達豐富。

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（責任編輯 馬鑫）

Identification and Expression Analysis of emx1 from Paralichthys olivaceus

SUN Wen-hui ZHANG Jun-ling SHI Zhi-yi SUN Jin-jin XIANG Yu-ting CHEN Xiao-wu
（Key Laboratory of Genetic Resources Freshwater Aguaculture and Fisheries，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

To explore the function of the empty spiracles homeobox 1（emx1）gene in the development of Paralichthys olivaceus，the emx1 was cloned by PCR，the sequence feature was analyzed by BioEdit and MEGA software，and the expression in early development and adult tissues was detected by real-time quantitative PCR. The obtained emx1 cDNA was 1 127 bp，including a 708 bp open reading frame（ORF），encoding a polypeptide of 235 amino acids. The alignment analysis of amino acid sequence discovered that the emx1 from P. olivaceus showed the highest 95% homology with that of Stegastes partitus and Poecilia formosa，the sequence similarities between P. olivaceus and Danio rerio，Astyanax mexicanus，Xenopus tropicalis，Gallus gallus，Mus musculus and Homo sapiens，were 87%，84%，83%，80%，72% and 72%，respectively. The Emx1 protein was highly homologous with that in other fish through phylogenic analysis. Real-time quantitative PCR revealed that the emx1 mRNA was expressed in all detected tissues of P. olivaceus. The expression of emx1 was the highest in the ovary and secondly highest in the testis，while relatively low in other tissues. In early development stage，i.e.，from gastrula to 10 d after hatching，a relatively high expression of the emx1 mRNA was also observed，and the highest expression occurred in the blastopore stage and heart-beating stage. The findings indicated that the emx1 played an important role in early development and gonad development stages of P. olivaceus.

emx1；Paralichthys olivaceus；cDNA cloning；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.023

2015-12-09

國家自然科學基金青年項目（41306128），國家自然科學基金面上項目（30271017）

孫文慧，女，碩士研究生，研究方向：牙鲆生殖與發育；E-mail：whsunok@163.com

張俊玲，女，副教授，碩士生導師，研究方向：魚類發育生物學；E-mail：jlzhang@shou.edu.cn