應用比色法檢測枯草芽孢桿菌變異菌株中1-脫氧野尻霉素含量

龍玲 楊艷 朱乃碩

（復旦大學生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室 微生物與分子免疫學研究室，上海 200438）

應用比色法檢測枯草芽孢桿菌變異菌株中1-脫氧野尻霉素含量

龍玲 楊艷 朱乃碩

（復旦大學生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室 微生物與分子免疫學研究室，上海 200438）

為尋找測定枯草芽孢桿菌黑色變種突變株Bacillus subtilis var. niger-231（B-231）的發酵液中1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）的新方法并提高其產發酵液中DNJ的含量。在有銅離子的存在下，DNJ與二硫化碳反應，用有機溶劑對產物萃取后在440 nm進行光度測定，得到DNJ含量。再采用紫外誘變方法處理突變株B-231。繪制了檢測DNJ標準品的標準曲線，對測定DNJ的新方法做了精密度、靈敏度、準確度以及產物的穩定性的探討，設計正交試驗優化了反應條件，并將此方法運用到細菌發酵液中DNJ含量的測定中，通過遺傳誘變手段處理原始細菌B-231，最終篩選到一株高產DNJ的菌株，命名為B. subtilis var. niger- 431（B-431），DNJ含量達87.3 mg/L，其產生DNJ的量較原始菌株原突變株提高了4.2倍。首次提出了一種快速測定細菌發酵液中的1-脫氧野尻霉素的新方法，紫外誘變手段使細菌產生DNJ的能力有較大提高。

枯草芽孢桿菌；1-脫氧野尻霉素；α-糖苷酶抑制劑；紫外誘變

1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）通過抑制α-糖苷酶活力和小腸刷狀緣對葡萄糖的吸收來改善糖尿病狀況［1，2］。進而改善餐后高血糖和胰島素敏感［2］。DNJ是一種小分子生物堿，其結構和葡萄糖十分相似，是葡萄糖分子六元環上面的氧原子被氮原子取代，且1號碳原子連接的氧原子被脫去而成。從桑樹的根部和葉子提取到［3］，一些芽孢桿菌和鏈霉菌也可以產生DNJ［2，4，5］，Kim 等［6］2011年報道從Chungkookjang（快速發酵豆醬，韓國的一種傳統食品）分離出產強的α-糖苷酶抑制劑菌株B. subtilis B2，后者的結構分析表明，它和在植物中提取到的DNJ結構一樣［7，8］。由于DNJ的抑制糖苷酶活力的作用，其在治療糖尿病［9］，同時在艾滋病感染［10］和心血管疾病［11］方面有潛在作用和應用前景。然而，受其來源限制，桑葉中DNJ含量低且提取工藝復雜，而化學合成方法不很成熟且無法大規模生產［12］，因此，應用微生物發酵來生產DNJ就顯得更加經濟有效。

如前所述，一些芽孢桿菌和鏈霉菌可以產生DNJ。然而這些細菌是從石油中分離到的，要想把它們應用到食品工業十分困難。Zhu等［13］報道了首次從發酵食品即豆渣分離到的枯草芽孢桿菌B. subtilis B2可以產生DNJ。用B. subtilis B2發酵的豆渣可能被用來生產食物來源的DNJ產品，可作為功能食品供糖尿病患者食用。然而，在凍干的發酵培養基中DNJ的含量僅為0.7 mg/g，和桑葉中的DNJ含量相當［14］。

目前，DNJ的檢測方法有對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法（PNPG）、反向高效液相色譜法（RP-HPLC）等。本實驗室應用了一種新的方法，在有銅離子存在下，仲胺與二硫化碳反應，生成有顏色的二烷基二硫代氨基酸銅［15，16］。DNJ與二硫化碳的反應式如下：

生產的黃色銅絡合物可用有機溶劑萃取后，進行光度測定。

紫外線誘變用于微生物育種的誘變處理有著悠久的歷史［17］。因此本研究采用簡單的紫外線誘變手段來選育產DNJ的高產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），超凈臺（蘇州凈化設備有限公司），細菌培養箱（上海博彩生物科技有限公司），搖床（上海博彩生物科技有限公司），低溫冷凍離心濃縮儀（上海和杰科技有限公司），通風櫥（Hamilton Scientific），熒光多功能酶標儀Spectrum M5（Molecular Devices）。

1.1.2 實驗材料 1-脫氧野尻霉素（上海世峰生物科技有限公司），二硫化碳、無水乙醇、吡啶、七水硫酸銅（試劑均為分析純），LB培養基（Sigma）。Bacillus subtilis var. niger-231（以下簡稱B-231）為本室篩選并保藏的產DNJ突變株［18］。

1.2 方法

1.2.1 DNJ標準品的測定方法 用移液器吸取試液100 μL至1.5 mL EP管中，加入二硫化碳200 μL，無水乙醇200 μL，吡啶20 μL和對應量的硫酸銅溶液，充分振蕩后靜置分層，取上層有色液于另一干凈的1.5 mL EP管中，吸取100 μL至96孔板中，每份試樣做3個重復，在440 nm波長下測定吸光度。取去離子水100 μL 至1.5 mL EP管中，按上述操作設定空白對照。

1.2.2 測定DNJ標準品的最佳條件探索 實驗試劑的種類、用量對檢測結果都會對實驗結果產生諸多影響，因此本實驗選擇了不同的醇類（乙醇、異丙醇、異戊醇）和不同用量、不同的CuSO4濃度、吡啶不同加入量，以檢測這些條件對反應結果的影響。為減少實驗次數及確定各因子對實驗的影響程度我們設計了正交試驗，按照四因素三水平設計實驗（表1）。

表1 正交試驗L9（34）正交表頭

1.2.3 紫外誘變方法處理 挑取在LB固體培養基上培養2 d的單克隆B-231接種到盛有50 mL液體LB培養基的250 mL的三角燒瓶中，37℃、150 r/min培養60 h，在6 500 r/min 4℃下離心3 min，棄上清，沉淀用0.9%生理鹽水洗滌3次，最后用生理鹽水制成約106CFU/mL的菌懸液原液。將原液用生理鹽水按10-6、10-5和10-4三個稀釋度稀釋，每個稀釋度取5 mL菌懸液于直徑為9 cm培養皿中，置15 W紫外燈30 cm處分別照射1 min、2 min、3 min、5 min、8 min。設未經紫外照射的菌液為對照組，各取0.1 mL菌液均勻涂布在LB平板上。

1.2.4 細菌發酵及發酵液的預處理 將LB平板上經過紫外誘變處理和對照組生長良好的單菌落用接種環轉接至含有100 mL LB液體培養基的三角燒瓶中，在30℃，150 r/min條件下培養60 h。取細菌發酵液1 mL，10 000 r/min離心3 min，保留上清液。取上清800 μL至1.5 mL EP管中，用低溫冷凍離心濃縮儀濃縮凍干，5 h后加200 μL去離子水溶解制備成細菌發酵濃縮液，備用。

1.2.5 突變DNJ高產菌株篩選 用移液器吸取濃縮菌液100 μL至1.5 mL EP管中，按1.2.1方法，每份試樣做3個重復，測定細菌發酵濃縮液中DNJ的含量。同時設定LB液體培養基為空白對照。篩選出DNJ高產突變菌株。

2 結果

2.1 標準曲線繪制

取5 mg/mL 1-脫氧野尻霉素1 mL，以去離子水稀釋成0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL，1.0 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液，制作標準曲線。結果（圖1）顯示，在一定范圍內，DNJ濃度與OD值之間呈較好的線性關系，符合直線回歸方程：y = 1.2254x + 0.22，R2= 0.9961。

圖1 DNJ標準曲線

2.2 精密度

取0.16 mg/mL 1-脫氧野尻霉素溶液平行測定5次，結果如圖2 所示，DNJ溶液在440 nm處有強的吸收峰，對應的吸光度OD值分別為：0.459 6，0.486 1，0.475 2，0.475 1和0.430 7，5次測定DNJ溶液吸光度的平均值為0.345 5，計算出5次測定的偏差分別是：-0.0057，0.020 8，0.009 9，0.009 8和-0.034 6。平均偏差d =0.016 2。

圖2 平行測定DNJ溶液在440 nm處吸收峰

2.3 靈敏度

對濃度為0.031 2 mg/mL和0.015 6 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液進行同上測定，得到吸光度分別為0.172 2和0.278 3。結果顯示，本法檢測DNJ標準品含量的最低檢測限為0.015 6 mg/mL，靈敏度為0.015 6 mg/mL。

2.4 回收實驗（準確度）

取0.125 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液100 μL三份，按0.8，1.0，1.2倍DNJ量加入5 mg/mL的1-脫氧野尻霉素2.0 μL，2.5 μL，3.0 μL，每份做3個重復，共測定9次。測得回收率分別為108.5%、109.2%和109.8%。

2.5 穩定性

取濃度為1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL和0.125 mg/mL，0.062 5 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液按1.2.1的測定方法，在90 min內，波長440 nm處每隔10 min測一次吸光度值，結果見圖3。從上往下曲線依次對應濃度為1.0 mg/mL，0.5 mg/mL，0.25 mg/mL，0.125 mg/mL，0.062 5 mg/mL，在90 min內，隨著DNJ溶液濃度的提高，產物的OD值隨時間變化而降低得更快。

圖3 90 min內DNJ溶液的吸光度變化

2.6 測定DNJ標準品的最佳條件

正交試驗結果見表2，根據正交試驗原理，極差越大，說明該因子對實驗結果影響越大。因此本次試驗中，對實驗影響大小：醇類 > CuSO4濃度 >醇加入量 > 吡啶加入量；K值越大，對應因子的水平越好，因此本次實驗最優水平也即本法最有反應條件為：乙醇，200 μL，CuSO4濃度0.03 mol/L，吡啶20 μL。

2.7 紫外誘變結果

菌懸液稀釋度為10-4的平板在誘變0 min、1 min、2 min、3 min、5 min及8 min后平均菌落數分別為131、89、44、18，3和1；菌懸液稀釋度為10-5的平板在誘變0 min、1 min、2 min、3 min、5 min及8 min后菌落數分別為28、15、6、4、1和0；菌懸液稀釋度為10-6的平板在誘變0 min、1 min、2 min、3 min、5 min和8 min后菌落數分別為6、2、0、1、0和0。菌落數在4個及以上時，隨機挑取4個單克隆液體發酵，菌落數小于4的則全部轉接至液體LB發酵。

2.8 應用比色法測定細菌發酵液中的DNJ含量

在發酵36 h、48 h和60 h之后，測得菌株B-231發酵液中的DNJ產量分別為17.6 μg/mL，20.4 μg/mL和33.8 μg/mL；測得誘變菌株發酵液中DNJ含量，發現其中有一株突變菌發酵液中DNJ含量特別高，在發酵36 h、48 h和60 h其發酵液中DNJ含量分別為48.7 μg/mL，55.6 μg/mL和87.3 μg/mL，該菌株編號為B. subtilis var. niger- 431（以下簡稱B-431）。結果如表3所示。其余菌株誘變后其發酵液中DNJ含量沒有顯著提高（數據未附上）。

表3 誘變前后細菌發酵液中DNJ含量

2.9 和RT-HPLC法測定細菌發酵液中DNJ含量的比較

參照Kim等［19］柱前衍生化反向高效液相色譜法，取細菌發酵液20 μL至1.5 mL EP管，加入5 mmol/L FMOC-Cl 40 μL，再加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH8.5）50 μL，充分混勻后25℃反應25 min，加入890 μL 0.1%乙酸，0.22 μm針濾，取10 μL上樣，測得B-431發酵60 h后DNJ含量為73.2 μg/mL。如圖4，FMOC-DNJ的出峰時間為第8.053-8.073 min。

3 討論

應用比色法測定1-脫氧野尻霉素標準品，結果在一定濃度范圍內取得良好線性關系，擬合優度R2= 0.996 1；5次平行測定平均偏差為0.878%，結果顯示出很好的重復性；加標回收實驗所得回收率在50%以上，準確度良好；該方法檢測下限達到15.625 μg/mL DNJ水溶液；穩定性實驗表明，在半個小時內完成對產物的檢測，結果可行度比較高。本法靈敏度、準確度高、操作簡便快速，而PNPG法采用大鼠的腸黏膜α-糖苷酶作為催化劑，利用DNJ對α-糖苷酶的抑制作用從而間接得出DNJ含量。由于酶活性易受較多因素影響，如溫度、pH、各種離子濃度、抑制劑或活化劑、同源分子的干擾等，此法對測定結果帶來一定的誤差，且重復性較差［19］。RP-HPLC法中的衍生化反應程度不易控制，硼酸鉀緩沖液的pH對衍生產物結果影響較大，衍生化產物不穩定易降解［20］，并且檢測需要高效液相色譜儀器，檢測成本高。本研究采用的比色法檢測細菌發酵液中DNJ的含量具有快速、靈敏的優點，與反向高效液相色譜法相比較，本法所測的細菌發酵液中DNJ含量稍微偏高，這可能與細菌培養液中含有較多的氨基酸有關，后者帶來一定的系統誤差。總體來說兩種方法測定結果比較接近，而在操作上RTHPLC更加繁瑣且成本更高。因此本法更適于測定細菌發酵液中DNJ含量。由于本方法尚屬于初步建立，在實際應用中可能存在各種干擾因素，目前僅用于測定高純度DNJ和細菌發酵液中DNJ含量，后續工作中，我們正在實際應用于其他樣品中以了解其各種干擾因素和可行性，目前正在試圖用該方法測定桑樹葉中的DNJ含量以證明該方法的普適性。

紫外線誘變育種的原理是，通過紫外線照射使DNA雙鏈之間或同一條鏈上的兩個相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，并阻礙雙鏈的分開、復制和堿基的正常配對，從而引起基因突變，最終導致微生物表形變化，紫外誘變是一種最常用的物理誘變因素，它經常被用于微生物育種。 因此本文采用紫外誘變來選育產DNJ高產菌株。通過紫外光照射處理細菌B-231，最終篩選到一株高產DNJ的菌株，命名為B-431，其產生DNJ的量較原始菌株B-231提高了4.2倍，DNJ含量達87.3 mg/L，比Zhu等［13］31 mg/L的DNJ含量也有了很大提高。最佳發酵時間為60 h，這與Zhu等［21］的最佳發酵時間66 h結論較為一致。

圖4 RT-HPLC法測定B-431發酵液DNJ

4 結論

本實驗應用比色法測定1-脫氧野尻霉素標準品，結果在一定濃度范圍內取得良好線性關系，采用遺傳誘變手段來處理枯草芽孢桿菌，使其DNJ產量達87.3 mg/L，較原始菌株原突變株提高了4.2倍。

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（責任編輯 李楠）

Colorimetric Method in the Determination of 1-Deoxynojirimycin Isolated from the Mutant Strain of Bacillus subtilis

LONG Ling YANG Yan ZHU Nai-shuo
（Laboratory of Microbiology and Molecular Immunology，State Key Laboratory of Genetic Engineering，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200438）

This work is to seek a novel method to detect 1-Deoxynojirimycin（DNJ）in the culture broth of Bacillus subtilis var. niger-231（B-231）and to improve DNJ production. DNJ reacts rapidly with carbon disulfide while Cu2+existing，and the final product extracted by organic solvent was measured by spectrophotometer at 440 nm，thus DNJ content was determined. Then mutant strain B-231 was induced with ultraviolet. The standard curve for measuring standard DNJ was drawn，and the precision，sensitivity，accuracy and stability of the products while using the novel method of measuring DNJ were studied. Orthogonal test was designed to obtain the optimal reaction condition. The novel method was applied to measure the content of DNJ in the culture broth of bacteria. A high-yield DNJ strain was screened and named as B. subtilis var. niger- 431（B-431）by mutagenizing the B-231. The content of DNJ by B-431 was up to 87.3 mg/mL，and increased 4.2 times compared to B-231. This study established a novel method to determine 1-deoxynojirimycin in the culture broth of DNJ-producing strain for the first time. The induction by ultraviolet increased the capacity of this bacterium producing DNJ.

Bacillus subtilis；1-deoxynojirimycin；α-glucosidase inhibitor；ultraviolet mutation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.027

2015-05-22

國家科技重大專項（2012ZX10002006-002-003），上海市科委科學基金項目（13431900602）

龍玲，女，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：13210700143@fudan.edu.cn

朱乃碩，男，教授，研究方向：微生物感染與分子免疫；E-mail：nzhu@fudan.edu.cn