重組融合蛋白Trx-IFN-CSP復性工藝研究

黃演婷盧雪梅楊小蓉金小寶朱家勇

（1. 廣東藥學院附屬第一醫院，廣州 510006；2. 廣東藥學院基礎學院藥用生物活性物質研究所，廣州 510006；3. 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006）

重組融合蛋白Trx-IFN-CSP復性工藝研究

黃演婷1，2，3盧雪梅2，3楊小蓉1金小寶2，3朱家勇2，3

（1. 廣東藥學院附屬第一醫院，廣州 510006；2. 廣東藥學院基礎學院藥用生物活性物質研究所，廣州 510006；3. 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006）

旨在建立并優化融合蛋白Trx-IFN-CSP的復性工藝。對重組融合Trx-IFN-CSP進行體外復性研究，考查pH、溫度、蛋白濃度、氧化還原體系及輔助復性小分子等復性條件對融合蛋白重折疊的影響。結果顯示，適合Trx-IFN-CSP復性的方法為，反復凍融聯合超聲破菌獲得包涵體；用含有1% TritonX-100、2 mol/L尿素、2% DOC洗滌液初步純化包涵體；再用6 mol/L鹽酸胍溶解液變性包涵體；脈沖加樣稀釋變性液后4℃條件下梯度透析復性，使用L-Arg輔助復性。經腸激酶切去Trx標簽后，每升發酵液最終獲得110-130 mg肝靶向干擾素，每批蛋白純度都在95%以上，比活性在1.9-2.4×108U/mg之間，制備工藝穩定。

融合蛋白；肝靶向干擾素；包涵體；脈沖稀釋；梯度透析

近年來，重組DNA技術的快速發展和蛋白質表達系統的多樣性為利用微生物大規模生產蛋白質藥物開辟了廣闊的空間。但是，重組蛋白的高表達常常導致其在胞內發生錯誤折疊和聚集，形成包涵體（Inclusoin bdoy）。目前，包涵體的形成機制仍不清楚，但一般認為包涵體是由部分折疊的中間態之間疏水性相互作用形成的，是蛋白質過量表達的結果，而與其相對分子質量、疏水性以及折疊途徑等內在性質沒有必然的聯系［1］。即對于任何蛋白質和任何表達系統來說，在過量表達的情況下都可能形成包涵體。包涵體表達量高且一級結構正確，經過變復性即可恢復蛋白生物活性，因此許多蛋白質藥物的生產依賴于蛋白質復性技術的提高。

1961年，Anfinsen［2］在研究RNaseA中發現蛋白質多肽鏈的折疊是一個自發的過程，主要決定于它的氨基酸序列，這也被稱為生物體內的第二套遺傳密碼。目前，雖然仍無法明確解釋蛋白質如何從伸展態轉變為具有生理活性的天然態。但普遍認為，分子間疏水作用是導致蛋白質聚集、變性蛋白復性收率降低的主要原因。隨著對蛋白質折疊機理的深入研究發現，暴露在變性蛋白表面的疏水基團既有通過分子內疏水作用逐步折疊為天然態蛋白質的趨勢，也有通過分子間相互作用形成二聚體、三聚體等無活性沉淀的趨勢。蛋白質的分子間疏水基團各不相同，所以沒有任何一種復性方法能復性所有的蛋白。對于某一特定蛋白的復性最佳方案，需要經過具體實驗研究確定。探討各種復性方法及相關因素，有助于尋找到最適宜的復性方案，對蛋白藥物的開發生產具有重要指導意義。

Trx-IFN-CSP是本實驗室通過基因工程方法構建的重組融合蛋白，初步研究證實具備了CSP I-plus高效而特異的肝細胞靶向性與IFN的抗HBV作用。本研究在前期基礎上旨在篩選出一套適合Trx-IFNCSP復性的方法，采用反復凍融聯合超聲破菌收集包涵體，經過洗滌后選用鹽酸胍溶解變性；考查pH、溫度、蛋白濃度、氧化還原體系及輔助復性小分子等復性條件對融合蛋白重折疊的影響，并驗證優化得出的制備工藝的穩定性，旨在為獲得一套穩定的肝靶向干擾素制備工藝和足夠肝靶向干擾素開展后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 含Trx-IFN-CSP基因的重組菌株E.coli

BL21/pET32a-IFN-CSP，系本課題組構建。

1.1.2 主要試劑 蛋白預染Marker購自Fermentas生物公司；DTT、GSSG、GSH、DOC購自Sigma公司；其余常用試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要溶液 （1）細菌裂解液：30%蔗糖、1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。（2）IBs洗滌液：10 mmol/L EDTA、1% Triton X-100、2 mmol/L尿 素、2% DOC、50 mmol/LTris-HCl。（3）IBs溶解液：6 mol/L鹽酸胍、5 mmol/L EDTA、2.5 mmol/L DTT、50 mmol/L Tris-HCl。（4）IBs稀釋液：2 mol/L鹽酸胍、0.1 mol/L精氨酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG、5%甘 油、50 mmol/L Tris-HCl。（5）透析外液A：1.5 mol/L鹽酸胍、0.1 mol/L精氨酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG、5%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（6）透析外液B：1.0 mol/L鹽酸胍、0.05 mol/L精氨酸、2 mmol/L GSH、0.2 mmol/LGSSG、3%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（7）透析外液C：0.5 mol/L鹽酸胍、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、3%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。（8）透析外液D：1%甘油、50 mmol/L Tris-HCl。

1.2 方法

1.2.1 包涵體的釋放 發酵液經6 000 r/min 離心10 min 后，棄上清收集菌沉，用0.1倍體積的4℃預冷的細菌裂解液重懸菌沉，-20℃結凍過夜后，37℃水浴凍融細胞，冰浴條件下使用超聲細胞破碎儀破碎30 min（功率450 W，工作2 s，停頓2 s）。破碎后于4℃，12 000 r/min 離心30 min，棄去上清，即得Trx-IFN-CSP包涵體粗品。

1.2.2 包涵體的洗滌與溶解 用IBs洗滌液重懸包涵體，漩渦混勻后室溫靜置15 min后，10 000 r/min，4℃離心10 min。分別于洗滌前后各取40 μL樣品，加入10 μL 5×SDS上樣緩沖液，混勻后沸水煮5 min，冷卻后10 000 r/min 離心10 min，吸上清，進行15% SDS-PAGE檢定，利用Gel DOCTM凝膠成像系統分析包涵體洗滌前后重組蛋白的比例。

將洗滌后的包涵體重懸于IBs溶解液，漩渦混勻，室溫放置至包涵體全部溶解。分別于溶解前后各取50 μL樣品，加入9倍體積的無水乙醇-20℃放置2 h，4℃，10 000 r/min離心15 min 收集沉淀，進行15% SDS-PAGE檢定，利用Gel DOCTM凝膠成像系統分析包涵體溶解前后重組蛋白的比例。

1.2.3 Trx-IFN-CSP的復性研究

1.2.3.1 pH對復性的影響 冰浴條件下，將包涵體變性液脈沖加樣逐滴加入不同pH值（pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5 和pH 9.0）的IBs稀釋液中，低溫放置2 h后，將稀釋后的變性液裝進透析袋中開始梯度透析，從透析外液A依次到透析外液D，每次透析至少8 h。測定上清液中的蛋白濃度及經腸激酶切去Trx標簽后，肝靶向干擾素的抗病毒活性以評價pH對復性的影響。

1.2.3.2 溫度對復性的影響 其他實驗條件不變，分別在0℃、4℃、11℃、25℃和37℃開始梯度透析。

1.2.3.3 蛋白濃度對復性的影響 其他實驗條件不變，調整IBs稀釋液的量使變性蛋白終濃度分別為100、200、300、400 和500 μg/mL，開始梯度透析。

1.2.3.4 氧化還原體系對復性的影響 其他實驗條件不變，將包涵體變性液脈沖加樣逐滴加入分別含有 Cysteine/Cystine、DTT/GSSG、β-ME/GSSG、GSH/ GSSG的氧化還原體系的IBs稀釋液中開始梯度透析。

1.2.3.5 小分子添加劑對復性的影響 其他實驗條件不變，將包涵體變性液脈沖加樣逐滴加入分別含有 Glycero、Tween-20、Glycine、Arginine、β-CD、CTAB、Sucrose輔助復性小分子的IBs 稀釋液中開始梯度透析。

2 結果

2.1 包涵體釋放

將收集的細胞重懸于30%高滲蔗糖緩沖液中，在-20℃結凍，滲透壓和低溫使細胞內的水分變成了冰晶，造成細胞明顯脫水，另外冰晶能對細胞膜造成物理損傷，在37℃水浴解凍時，細胞吸水溶脹將導致細胞壁部分破碎，經過反復凍融處理可進一步提高細菌破碎率。由于超聲破碎過程中有大量熱量釋放，所以使用冰浴及間歇破碎的方式，對于達到較好的破碎效果以及避免Trx-IFN-CSP包涵體的熱變性有重要作用。細胞破碎后，8 000 r/min 離心30 min，棄去上清，即獲得包涵體粗品。1 L發酵液可得到1.17 g Trx-IFN-CSP包涵體。

2.2 包涵體的洗滌及溶解

超聲破菌后高速離心獲得的包涵體沉淀除了融合蛋白外，還含有膜蛋白及脂質體等其他成分，而這些成分會影響包涵體蛋白的變復性。所以溶解變性前應先洗滌包涵體，以去除雜質。對包涵體的洗滌時發現，洗滌液的成分不同對包涵體的洗滌效果有較大的影響。首先實驗發現鹽酸胍洗滌包涵體會造成融合蛋白的大量損失，而低濃度的尿素的洗滌效果更好。再者實驗結果證明1% TrionX-100和2% DOC對宿主菌蛋白有很好的增溶作用，但是TrionX-100 洗滌時間不宜過長，否則也會導致目的蛋白的降解。利用2 mol/L尿素、1% TrionX-100和2%DOC聯合洗滌的方法，有很好的純化效果，15%SDS-PAGE 顯示（圖1-A，條帶3）其純度為62.3% 左右，而且包涵體的可溶性大大提高。

在洗滌過后，包涵體的純度及可溶性都有所提高，在此基礎上分別選用過8 mol/L尿素和6 mol/L鹽酸胍變性包涵體，實驗結果表明Trx-IFN-CSP包涵體在8 mol/L尿素中溶解相當困難，超聲助溶及37℃震蕩助溶效果都不理想，而使用6 mol/L鹽酸胍變性，室溫放置30 min則可有效地將包涵體溶解。為了徹底的將包涵體中的二硫鍵打開，提高包涵體溶解度，降低重組蛋白的損失率，在IBs溶解液中加入5 mmol/L EDTA 和2.5 mmol/L DTT，15% SDSPAGE 顯示（圖1-B，條帶3）其純度為64.7%。

2.3 Trx-IFN-CSP的復性研究

2.3.1 pH對復性的影響 不同pH對復性的影響結果示于圖2-A?？芍趐H7.0-8.0 時復性的融合蛋白活性高于其他pH復性的樣品，干擾素對于發揮其生物活性作用時的pH有嚴格的范圍，若超出范圍其活性受限。所以當pH偏酸或偏堿時，包涵體雖然可以發生折疊，但折疊后的融合蛋白處于不利于保持其活性的環境中，活性易喪失。當復性液pH為7.0和7.5時，其蛋白收率明顯低于pH8.0。當蛋白質處于等電點時蛋白質的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質分子之間沒有靜電斥力而趨于結聚形成沉淀，所以復性pH應避開蛋白質等電點。由此可見，Trx-IFN-CSP復性宜在pH8.0左右進行。

圖1 融合蛋白洗滌、變性溶解結果

2.3.2 溫度對復性的影響 溫度對復性的影響結果如圖2-B。由圖可知，在4℃復性的融合蛋白的活性和收率都高于在25℃和37℃復性的樣品。包涵體變性蛋白在折疊過程中，分子內的疏水氨基酸殘基暴露在外，使多肽鏈的疏水基團之間相互發生碰撞，形成錯誤折疊導致蛋白聚沉。而隨著復性溫度的升高，疏水作用力增強，使聚集體更容于形成，造成活性及收率的降低。由此可見，Trx-IFN-CSP復性宜在低溫條件（4℃）下進行。

2.3.3 蛋白濃度對復性的影響 不同蛋白濃度對復性的影響結果示于圖2-C。傳統的稀釋復性時，復性液的蛋白濃度需在10-100 μg/mL 才會有較理想的復性效率，但這無疑會加大對活性蛋白回收的難度，不利于大規模操作。所以本研究選用脈沖加樣的方式稀釋變性液。當復性體系中蛋白濃度為200 μg/mL、300 μg/mL 時，復性后融合蛋白的活性與100 μg/mL 時復性的相當。而復性體系中各蛋白濃度對蛋白收率的影響不大。脈沖稀釋時，保證了有足夠的時間間隔使蛋白折疊通過易聚集的早期中間體階段，Trx-IFN-CSP包涵體變性蛋白的終濃度越低，越有利于變性蛋白的重折疊。在復性時，蛋白中間態含有大量的疏水基團，溶液中蛋白濃度越高，分子間作用力越大，蛋白質分子間聚合趨向性就越大，蛋白質相互結合形成寡聚體或多聚體，這些聚合體再進一步聚合則形成沉淀，導致復性失敗。蛋白濃度一般在200-300 μg/mL為宜。

2.3.4 氧化還原體系對復性的影響 不同氧化還原體系對復性的影響結果示于圖2-D。4對氧化還原體系實驗組中，GSH/GSSG復性組的融合蛋白復性后比活性高于其他實驗組，而各組氧化還原體系對Trx-IFN-CSP復性的蛋白收率影響不大。Trx-IFN-CSP含有兩對半胱氨酸，在重折疊過程中通過添加氧化還原體系來提供合適的氧化還原電位，GSSG負責促進二硫鍵的形成，而GSH則催化錯誤配對的二硫鍵進行重排，可促進其二硫鍵的正確配對。DTT/GSSG和β-ME/GSSG復性組的比活性低的原因可能是由于GSSG與DTT和β-ME的比例超出了合適范圍，以致于復性液還原性太強，二硫鍵將難以形成。

2.3.5 小分子添加劑對復性的影響 不同輔佐復性小分子對復性的影響結果示于圖3。添加了輔助復性小分子的各復性組的比活性和蛋白收率與對照組相比都有大大的提高。這些輔助添加劑一般情況下都是通過增強分子間相互作用來穩定蛋白質的天然結構，或是通過減弱分子內的疏水作用來抑制聚集體形成，從而輔助蛋白折疊。其中L-Arg的輔助效率最高，表明L-Arg可選擇性與錯誤折疊結構結合，使錯誤折疊的分子不穩定從而促進分子形成正確構象，其輔助復性有一定的通用性，因為其結合錯誤折疊分子時不具有蛋白質種類特異性。

2.4 Trx-IFN-CSP復性工藝的穩定性

綜合上述實驗的結果，得出一套適合Trx-IFNCSP復性的方法：將包涵體變性液脈沖加樣緩慢逐滴加預冷的IBs稀釋液中，將變性液蛋白濃度調至300 μg/mL 左右，低溫放置2 h后，開始梯度透析復性，溫度4℃，從透析外液A依次到透析外液D，每次透析至少8 h。對復性前后的蛋白進行15% SDS-PAGE 檢定，上樣量10 μg，利用Gel DOCTM凝膠成像系統分析結果（圖4）顯示融合蛋白復性后純度達95.0%。

連續3次進行Trx-IFN-CSP的制備，確認該工藝的合理性與穩定性，同時大量獲得Trx-IFN-CSP。結果如表1所示，經腸激酶切去Trx標簽后，每升發酵液最終獲得的肝靶向干擾素約110-130 mg之間，每批蛋白純度在95%以上，比活性在1.9-2.4×108U/mg之間，制備條件穩定。

圖2 Trx-IFN-CSP的復性條件研究

圖3 添加劑對Trx-IFN-CSP包涵體復性的影響

3 討論

Trx-IFN-CSP是本實驗室通過基因工程方法構建的重組融合蛋白，是將IFN-α2b與瘧原蟲環子孢子蛋白多肽CSP I-plus進行融合，連接到pET32a載體上表達而獲得的。Trx-IFN-CSP經腸激酶切去Trx標簽后即獲得肝靶向干擾素（IFN-CSP），旨在利用CSP I-plus高效特異的肝細胞靶向性可將IFN-α2b導向肝臟，使其在肝臟富集，有從而提高干擾素治療乙型肝炎病毒慢性感染的特異性，減少全身用量，降低毒副反應，提高量效比。初步研究證實，肝靶向干擾素具備了CSP I-plus高效而特異的肝細胞靶向性與IFN的抗HBV作用，有重大的開發應用潛力。本研究正是為了獲得一套穩定的肝靶向干擾素制備工藝，為開展后續新藥研究工作奠定物質基礎。

Anfinsen［2］經典的RNaseA折疊研究中發現蛋白質的結構、穩定性和功能的全部信息都來源于其氨基酸組成和排列；多肽鏈的折疊是一個自發的過程，主要決定于它的氨基酸序列。這一規律也被稱為生物體內的第二套遺傳密碼。不同的蛋白質需要的復性條件不同，相同的因素對不同蛋白質的復性的影響也不同。本研究結合稀釋復性及透析復性方法復性，一方面無需過大地增加溶液體積，便于后續回收；另一方面提高復性率。

圖4 Trx-IFN-CSP包涵體復性

表1 肝靶向干擾素連續三批制備結果

稀釋和透析都是傳統的復性法，其方法簡單，易于實驗室操作［3］。但在單純的稀釋復性時，為了減少聚集提高復性收率，通常需要在很低的蛋白濃度（10-100 μg/mL）下進行［4］。這對于于大規模工業生產來說，效率太低，后續工作過多而顯得不大實際。Katoh等［5］將流加操作引入復性過程，即脈沖稀釋，以流加的方式向復性緩沖液中注入變性蛋白質。這種復性方法已在變性溶菌酶復性中得到了驗證。所以本研究采用了復性，以求在提高蛋白質復性收率的同時設法增大蛋白質濃度，使復性過程中維持較低的變性蛋白濃度而復性終蛋白濃度較高，其關鍵在于掌握變性蛋白加入的時間間隔，在后一部分加入之前，前一部分有一段時間可以折疊，相當于降低了稀釋時復性體系中變性蛋白的濃度，從而降低了變性蛋白發生分子間作用而聚集沉淀的幾率。脈沖稀釋復性在每次蛋白加入之間，保證有足夠的時間間隔使蛋白折疊通過易聚集的早期中間體階段，提高單位體積復性液的復性蛋白量，是實現高復性濃度下的稀釋復性的一條途徑。

在優化復性方式的基礎上，本實驗對影響復性的因素如pH、溫度、變性蛋白質的濃度以及氧化還原體系進行考察，以經腸激酶去除Trx標簽后肝靶向干擾素的比活性與融合蛋白收率為雙指標，摸索出較優的復性條件。（1）體外折疊復性的緩沖液pH值?？刂圃?.0-9.0之間，這是因為堿性環境能夠防止變性蛋白質中還原的自由巰基因為硫醇質子化作用而影響二硫鍵的正確形成［6］。在不同pH值下，蛋白質所帶電荷量不同，在溶液pH值等于其pI時，蛋白質所帶凈電荷數最少，而蛋白質帶電荷的情況直接影響其在溶液中的穩定性，進而影響其在復性中的行為［7］。所以復性液pH在偏堿性的同時還需盡量遠離蛋白的pI值，以減少蛋白質的聚集。（2）折疊復性的溫度范圍為0-40℃［8］，在這個溫度范圍內，折疊復性的速度和復性率隨溫度的增高而增高，但聚集的速度也隨之增高。低溫時復性雖慢但成功率高。（3）復性過程中蛋白的折疊為一級反應，而蛋白質的聚集是二級以上的反應［9］，其速度受濃度影響大，低蛋白濃度有利于獲得較高的復性收率。在復性時，當蛋白質濃度過大會產生不穩定的中間物，使疏水基暴露在中間物表面，在疏水基團相互作用下，產生聚集沉淀物。如此不但產物收率降低，還增加了不溶性無活性蛋白質聚積物。（4）氧化還原體系，是由小分子氧化型和還原型的巰基化合物混合組成。蛋白質折疊的機制顯示，具有二硫鍵蛋白質的復性成功與否與二硫鍵的形成與重排緊密相關。由于體外折疊沒有二硫鍵異構酶的存在，蛋白質折疊時巰基氧化容易產生錯誤配對的二硫鍵。所以需要氧化還原體系幫助蛋白質通過分子內重排成天然配對，二硫鍵的重排過程可能是這類蛋白質折疊的限速步驟。

在復性過程中產生聚集體的主要原因是蛋白質肽鏈間的疏水相互作用［1］，因此抑制肽鏈間的疏水相互作用是提高復性收率的關鍵。為此，本研究比較了多種折疊促進劑和聚集抑制劑（Glycero、Tween-20、Glycine、Arginine、β-CD、CTAB、Sucrose）輔助Trx-IFN-CSP復性的效果。助折疊劑穩定蛋白質的原理在于它們能被蛋白質優先排斥，結果使蛋白質優先水化，從而增加蛋白質的穩定性［10］。聚集抑制劑是通過減弱分子內的疏水作用，從而穩定天然構象來抑制聚集發生［11］。蛋白質穩定性的提高表明從變性態到復性態的過程是熱力學有利的過程，也就是說滲透質的加入可以促進蛋白質的折疊。實驗結果顯示，L-精氨酸對Trx-IFN-CSP復性的輔助效率最高。早在Fischer［12］和Buchner［13］的復性研究中，已經發現L-精氨酸可以大大提高變性蛋白的復性成功率，分別是80%和100%。雖然，對L-精氨酸輔助蛋白復性的機制尚不完全清楚，但相關研究發現與低濃度的鹽酸胍及脲相比，L-精氨酸對蛋白質的穩定性影響微弱，因此推測可能是其增加了折疊中間體的溶解度才促進了復性。

4 結論

通過反復凍融聯合超聲破菌能高效獲得包涵體蛋白，尿素洗滌后再用鹽酸胍變性、脈沖加樣稀釋后梯度透析復性，建立了較為穩定的制備工藝。經腸激酶切去Trx標簽后，每升發酵液可制備純度95%以上、比活性在（1.9-2.4）×108U/mg之間的肝靶向干擾素110-130 mg。

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（責任編輯 李楠）

Renaturation Technology of Recombinant Fusion Protein Trx-IFN-CSP

HUANG Yan-ting1，2，3LU Xue-mei2，3YANG Xiao-rong1JIN Xiao-bao2，3ZHU Jia-yong2，3
（1. The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006；2. Institution of Pharmaceutical Bioactive
Substances，School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006；3.Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006）

This work is to establish and optimize the method of refolding fusion protein Trx-IFN-CSP. The refolding of recombinant protein in vitro was studied，i.e.，investigating the effects of pH，temperature，protein concentration，redox systems and auxiliary refolding molecules on the refolding process of fusion protein. The results were as below. The proper measure to refold the Trx-IFN-CSP was to obtain the inclusion bodies by repeated combined freeze-thaw with ultrasonic to crack bacteria. The inclusion bodies were preliminarily purified using scrub solution of 1% TritonX-100，2 mol/L urea，and 2% DOC，and then denatured in 6 mol/L guanidine hydrochloride. After the pulse dilution，the renaturation was conducted under 4℃ by gradient dialysis with the assistance of L-Arg. After the Trx-tag was removed by recombinant enterokinase digestion，approximately 110-130 mg of the pure recombinant liver-targeted interferon was obtained from 1 L Escherichia coli culture. Each batch of protein had a purity of over 95% and antibacterial activities were about 1.9-2.4×108U/mg，thus the technology of preparation was stable.

fusion protein；liver-targeted interferon；inclusion body；pulse dilution；gradient dialysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.032

2015-08-02

國家科技部新藥創制重大專項項目（2013ZX09103003-003）

黃演婷，女，碩士,研究方向：藥用生物活性物質結構、功能與應用；E-mail：olive1987@aliyun.com

朱家勇，男，教授，博士生導師，研究方向：藥用生物活性物質結構、功能與應用；E-mail：zhujy@gdpu.edu.cn