脂肪間質干細胞移植對肝硬化大鼠的實驗研究?

李 蓉(陜西省西安市第一醫院， 陜西 西安 710002)

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脂肪間質干細胞移植對肝硬化大鼠的實驗研究?

李 蓉
(陜西省西安市第一醫院， 陜西 西安 710002)

摘 要:目的:研究脂肪間質干細胞經門靜脈及尾靜脈移植入肝硬化大鼠后的治療效果。方法:選取45只Wister大鼠，采用隨機對照方法將Wister大鼠分為對照組、門靜脈移植組及尾靜脈移植組。3組先用相同方法制造肝硬化模型，隨后，門脈移植組及尾靜脈移植組分別從門靜脈和尾靜脈注射2mL細胞數量為2×106個脂肪間質干細胞懸液，對照組注入2mL細胞培養液，6周后觀察三組大鼠治療效果。結果:門靜脈組大鼠肝臟邊緣變鈍，表明紋理變粗，大鼠肝臟形態改變程度較輕；對照組及尾靜脈組大鼠肝臟質地則比較生硬，肝臟萎縮，顏色暗淡，出現不同成度的肝硬化；三組治療前AST、ALT、ALB及總膽紅素(TBIL)指標差異不顯著(P＞0.05)；門靜脈組大鼠AST、ALT、總膽紅素(TBIL)指標顯著低于對照組和尾靜脈組(P＜0.05)；ALB顯著高于對照組和尾靜脈組(P＜0.05)；對照組肝臟在顯微鏡下顯示：肝臟出現不同程度的變性、壞死，肝細胞脂肪變性占小葉比例2/ 3以上；尾靜脈組肝臟出現纖維化，且細胞數少于對照組；門脈組大鼠肝臟纖維化程度最輕，光鏡下甚至能夠看見正常肝臟細胞。結論:脂肪間質干細胞便于獲取，易于分離、培養，且容易與外源基因導入和表達，屬于進行干細胞移植治療肝硬化的新型種子細胞。其經門靜脈及尾靜脈移植，能夠有效的改善肝硬化大鼠的肝功能并改善肝纖維化及肝硬化程度，具有重要的研究價值。

關鍵詞:脂肪間質干細胞； 門靜脈； 尾靜脈移植； 大鼠肝硬化

肝硬化是由于一種或多種病因長時間滯留在患者體內而不斷反復作用逐漸形成的彌漫性肝損害。在我國絕大多數的病人是肝炎發病長時間得不到及時的治療，最終演變為肝硬化。研究顯示:全世界范圍內肝硬化的發病率為2500/10萬人口，并且每年超過50萬人口死于肝硬化[1]。目前，臨床上對于肝硬化尚缺乏理想的治療方法，藥物治療雖然能夠改善患者癥狀，但是預后較差。再生醫學是利用機體的正常組織中某些細胞的特性以及創傷修復與再生功能，實施不斷分化最終尋找科學合理的生物治療方法，促進機體的自我修復、再生，或者可以構件新組織以及器官，有效維持、修復再生的組織和器官[2]。

用于慢性肝臟疾病的常見細胞有:雙能干細胞、多能干細胞、原代細胞等。雖然能改善患者肝功能，但部分細胞體外擴增能力較差、缺乏特異性等[3]。肝臟內的微環境在某種程度上說有一定獨特肝臟組織以及肝非實質細胞的相互作用，在條件運行的情況下可以有效的促進移植細胞的進一步增殖和分化作用。研究顯示:從人體或動物脂肪中分離得到的脂肪間脂干細胞經過一定條件下的培養能夠表現出和肝臟細胞類似的細胞分化能力。目前臨床上對于脂肪間質干細胞在動物及臨床中的研究相對較少，因此研究脂肪間質干細胞對大鼠肝硬化的治療效果具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料:2013年12月至2015年1月期間，對西安交通大學醫學院實驗動物中心的45只實驗大鼠進行分析，探討脂肪間質干細胞經門靜脈及尾靜脈移植后對大鼠肝硬化的治療效果。

1.1.1實驗動物:45只Wister大鼠，體重為(0.16～0. 40)kg，平均(0.20±0.01)kg，雌雄隨機，飼養嚴格遵守相關標準。對大鼠進行等條件喂養，對大鼠的處理符合《關于善待實驗動物的指導下意見》中相關規則。采用隨機對照方法將Wister大鼠分為對照組、門靜脈移植組及尾靜脈移植組，每組15只。

表1　主要儀器和試劑

1.1.2主要儀器和試劑:胎牛血清、DMED培養液、磷酸鹽緩沖液、胰酶消化液，CD44、CD29、CD45等相關克隆抗體試劑盒。廣譜細胞角蛋白抗體、SABC通用型免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、Nikon生物光學攝影顯微鏡等。相關試劑和儀器廠家如下(見表1)。

1.2實驗方法

1.2.1ADMSCs的分離培養:無菌操作下從健康Wister大鼠腹股溝皮下獲得脂肪組織，剪碎后放入1g/ L膠原酶消化，振蕩搖勻。下層液體使用篩網進行清潔，并進行過濾處理，離心3min，速度800r/ min，加入紅細胞裂解液進行懸浮處理，靜止15min再次離心，去除其存在的殘余雜質。另棄去上清加入含量為100mL/ LFBS的DMEM培養液，充分混合均勻之后接種在培養皿中，在37℃的溫度條件下，50mL/ L CO2孵箱中培養24h，再對其進行首次換液處理，新鮮的培養液加入到貼壁細胞，每2～3d換液一次。在細胞增殖完全融合到培養皿底80%的情況下，胰酶消化依據1∶1比例進行傳代。將第3～5代所得的貼壁細胞做出細胞懸液，其標簽的標定濃度為1.0×106，各個試管可裝入2mL，置于孵箱中以備移植使用。

1.2.2大鼠肝硬化模型建立[4]:大鼠食用普通飼料，并根據5mL/ kg劑量在腹腔內注射40%四氯化碳植物油溶液，每周2次，連續注射3周。同時，大鼠飲食10%乙醇溶液。第4周注射50%四氯化碳中性植物油溶液，每周3次，連續注射3周；改用為30%的乙醇溶液作為其飲用水。制備大鼠模型共使用6周。

1.2.3三組肝硬化大鼠治療:大鼠在誘導肝損傷6周后，門靜脈組大鼠按照要求注射10mg/ L水合氯醛實施麻醉，于大鼠腹部正中做一個3cm的胃腸切口，使用26G細針實施血管穿刺，在完全確定針，對位于門靜脈血管內之后，緩慢注射2mL的大鼠ADMSCs懸液，此時通過計算能夠發現細胞懸液中有細胞2×106個左右，之后可將細針拔出，同時穿刺的部位使用明膠海綿對其實施止血處理，并關閉大鼠腹腔。尾靜脈組大鼠則從尾靜脈注射2mL的大鼠ADMSCs懸液；對照組是從尾靜脈注射相同劑量的細胞培養液[5]。

1.3觀察指標

1.3.1大鼠肝硬化模型蘇木清-伊紅染色:大鼠模型建立后取肝臟進行病理學檢測。觀察肝硬化組織情況。

1.3.2肝功能指標的檢測:大鼠在治療前及治療后6周抽取1.5～2mL尾靜脈血，進行肝功能相關指標檢測。采用生化檢測儀對采集血液進行肝功能檢測，檢測指標主要包括:天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶( ALT)、白蛋白( ALB)及總膽紅素(TBIL)。

1.3.3組織病理學檢查:將門靜脈組、尾靜脈組肝硬化大鼠，脂肪間質干細胞治療6周后將大鼠處死，并取出肝臟，采用生理鹽水進行沖洗，觀察大鼠形態。對照組用相同劑量的細胞培養液注射6周后，用同上方法處理。最后將三組大鼠肝臟采用100g/ L甲醛溶液進行72h固定，采用石蠟包埋切片，并進行HE染色[6]。

1.3.4統計學處理:對研究數據用SPSS18.0軟件進行處理，肝功能指標用s描述，組間比較采用單因素分差分析，重要比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05，為存在統計學差異。

2　結 果

2.1實驗動物數量分析:45只大鼠全部進行結果分析，中途無死亡。

2.2肝硬化大鼠組織分析:蘇木精-伊紅染色結果顯示:肝硬化大鼠細胞疏松、濁腫，存在少許脂肪變，且存在炎細胞浸潤，肝小葉結構模糊不清，有多個大小不等的假小葉形成(見圖1)。

圖1　肝硬化模型大鼠肝組織蘇木精-伊紅染色結果(×200)

2.3脂肪干細胞培養生長及鑒定:在顯微鏡下脂肪干細胞呈現梭形細胞貼壁，細胞形態不一，且細胞核居中；脂肪間質干細胞培養3～5d后發現脂肪間質干細胞生長茂盛，排列具有一定方向性(圖2)。同時，脂肪間質干細胞常規免疫熒光染色顯示細胞CD29、CD44等均為陽性，CD45為陰性。

圖2　脂肪干細胞倒置顯微鏡下圖(×100)

2.4肝功能指標檢測:本次研究中，三組治療前AST、ALT、ALB及總膽紅素(TBIL)差異均無統計學意義(P ＞0.05)；治療后門靜脈組大鼠AST、ALT、總膽紅素(TBIL)指標顯著低于對照組和尾靜脈組(P＜0.05)；ALB顯著高于對照組和尾靜脈組(P＜0.05)(見表2)。

表2　細胞移植治療前后各組別大鼠肝功能指標檢測結果比較

2.5大鼠肝臟組織的HE染色結果:本次研究中，對照組肝臟在顯微鏡下顯示:肝臟出現不同程度的變性、壞死，肝細胞脂肪變性占小葉比例2/3以上；尾靜脈組肝臟出現纖維化，且細胞數少于對照組；門靜脈組大鼠肝臟纖維化程度最輕，光鏡下甚至能夠看見正常肝臟細胞(圖3)。

圖3　大鼠肝臟組織的HE染色結果(×200倒置顯微鏡)

3　討 論

隨著基因技術飛速發展，干細胞移植在肝硬化患者中廣為使用，并且在臨床上研究相對較多。尤其骨髓間質干細胞的研究。研究顯示[7]:將骨髓間質干細胞(bone marrow mesenchyma1 stem ce11s，BMSCs)移植入肝硬化的動物中效果理想，能夠有效的改善動物肝臟損害程度，并且能夠在一定程度上抑制肝臟纖維化的形成。而在臨床應用方面，相關學者進行了一次實驗[8，9]，實驗中從肝硬化患者身上分離、鈍化出骨髓間質干細胞并將其移植到肝臟，實驗結果顯示:患者手術后肝功能、凝血功能等均得到改善，由此看出:BMSCs肝內移植能夠有效的緩解肝硬化患者肝功能的損害，改善其生活質量，并且使用該方法治療時并未出現明顯的并發癥，安全性較高。

早在2001年，第一次從人體脂肪中分離出干細胞，并證實脂肪間質干細胞在一定條件下能夠向成骨、脂肪和成肌等方向進行分化。研究結果顯示:脂肪間質干細胞在機體內采用干細胞生長因子等進行誘導，能夠定向分化形成肝細胞，能夠有效的改善患者肝功能。同時，脂肪間質干細胞和其他干細胞相比來源更加充裕、易于獲取，并且獲取量較大，能夠進行反復取材。由此表明:脂肪間質干細胞適合用于肝硬化的治療。另有研究顯示:移植細胞在肝臟內環境下和其他多種因子共同作用下能夠發揮肝臟細胞樣細胞的功能，能夠共同參與肝臟代謝和肝組織重建工作。

但是，對于脂肪間質干細胞在機體內如何抑制肝硬化進一步發展機制尚不知曉，可能的機制如下:①脂肪間質干細胞在干細胞生長因子誘導下在肝臟內分化為功能性干細胞，從而能夠有效的促進肝細胞再生；②脂肪間質干細胞通過誘導肝星狀細胞凋亡或抑制肝星狀細胞活性等功能而抑制肝組織纖維化的形成。臨床上，對于脂肪間質干細胞治療肝硬化仍需要克服許多難題。本項研究結果顯示:門靜脈組大鼠肝細胞變性及肝纖維化程度顯著低于尾靜脈組(P＜0.05)；由此看出:大鼠在治療過程中選擇何種注射部位具有重要的意義。不同的注射部位治療過程中存在明顯的差異，可能的原因為:第一大鼠在治療過程中通過門靜脈移植干細胞治療，在相同條件下能夠到達肝臟的有效細胞更多，參與肝臟修復的細胞也相對較多；再者通過門靜脈途徑移植細胞能夠保證細胞植入后在肝臟內部分布更加均勻，更加接近人體正常肝臟的運作功能，移植干細胞在機體肝臟組織越容易停留，從而能夠更好的發揮其治療功能。

參考文獻:

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Cirrhotic Rat Model Treated with Adipose Mesenchymal Stem Cells

LI Rong
(The First Hospital Affiliated to Xi'an Medical College，Shanxi Xi'an 710002，China)

Abstract:Objective:To investigate the c1inica1 effect of adipose mesenchyma1 stem ce11s transp1anted from the porta1 vein and cauda1 vein graft c1inica1 in treatment of 1iver cirrhosis in rats. Method: 45 Wister rats data were ana1yzed，and using random1y contro11ed method，were divided into the contro1 group，the porta1 transp1antation group and tai1 vein graft group，with 15 in each group. The porta1 transp1antation group and tai1vein transp1antation group were intraveous1y injected from the tai1 and porta1 vein 2mL intergovernmenta1 fat stem ce11 suspension with 2×106ce11s，the contro1 group injected 2mL ce11 cu1ture medium，the treatment effect was observed on three groups of rats in six weeks. Result: Liver porta1 vein group b1unt edge indicated thicker texture；The 1iver texture of the contro1 group and the tai1 vein group was re1ative1y stiff，1iver atrophy and dark co1ors，there was different degrees of cirrhosis；of the three groups before treatment，AST，ALT，ALB and tota1 bi1irubin (TBIL) index was not significant1y different (P＞0.05)；AST，ALT and TBLL index of the porta1 group were significant1y 1ower than those of the contro1 group and the tai1 vein group (P＜0.05)；ALB significant1y higher than that of contro1 group and the tai1 vein group (P＜0.05)；the 1iver of the contro1 group under the microscope showed: there were different degrees of 1iver degeneration and necrosis，hepatic steatosis proportion accounted for more than 2/3 of 1obu1es；1iver fibrosis was found in tai1 vein group，and the number of ce11s was 1ess than that of the contro1 group；1iver fibrosis of the porta1 group was 1ightest，norma1 1iver ce11s cou1d be seen under 1ight microscope. Conclusion: Adipose mesenchyma1 stem ce11s are easi1y separated，cu1tured，and esi1y ferried and expressed with exogenous gene，be1onging to the new seed ce11s in the treatment of cirrhosis with 1iver transp1antation，after transp1antation，it can effective1y improve the body's 1iver function and pro1ong 1ife of the body，which has important research va1ue.

Key words:Adipose mesenchyma1 stem ce11s； Porta1 vein； Tai1 vein transp1antation； Liver cirrhosis

文獻標識碼:A

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.02.002

文章編號:1006-6233(2016)02-0180-05

基金項目：?陜西省衛生廳科學研究基金項目，(編號：14H21)