實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦組織PGE2表達的研究

黃蕾 李作孝 彭仕軍 羅章坤

實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦組織PGE2表達的研究

黃蕾 李作孝 彭仕軍 羅章坤

目的 檢測實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠腦組織PGE2表達情況，探討其在EAE發病過程中的作用。方法 將30只Wistar雌性大鼠隨機分為正常對照組、佐劑對照組及EAE模型組，各10只，使用新鮮豚鼠脊髓勻漿（GPSCH）與含卡介苗(BCG)的弗氏完全佐劑（CFA）建立EAE模型。對各組大鼠發病潛伏期、進展期及發病高峰期神經功能障礙評分進行記錄，采用免疫組織化學方法檢測大鼠腦組織前列腺素E2（PGE2）的表達，并用ImagePro Plus軟件對PGE2含量進行平均光密度值測定。結果 正常對照組及佐劑對照組大鼠未發病，EAE模型組大鼠均發病。正常對照組及佐劑對照組大鼠腦組織中未見PGE2表達，EAE模型組大鼠腦組織中則可見PGE2表達，且PGE2含量與EAE大鼠發病潛伏期呈負相關，與發病進展期及發病高峰期神經功能障礙評分呈正相關。結論 PGE2可能參與了EAE疾病的發生發展過程。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎；前列腺素E2；多發性硬化；Th 1細胞；Th 17細胞

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經系統（central nervous system，CNS）炎性脫髓鞘疾病。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）因其臨床表現與病理特征和MS高度相似故成為研究MS的理想動物模型。MS及EAE的具體發病機制迄今不明。本實驗通過測定EAE大鼠腦組織PGE2表達含量，分析其與EAE大鼠臨床癥狀之間的相關性，目的在于探討PGE2在EAE發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 Wistar雌性大鼠30只，6周齡體質量210～230 g；健康成年豚鼠3只，體質量350～400 g。所有動物均購自四川大學華西實驗動物中心，為一級合格動物。

1.2 實驗主要試劑 弗氏完全佐劑（美國Chondrex公司）；卡介苗凍干粉：60 mg／支(上海生物制品研究所)；Rabbit Anti-PGE2(美國Bioworld公司)。

1.3 免疫抗原制作 將脊髓從麻醉后已行心臟灌流的豚鼠體中取出，加入無菌生理鹽水，于冰浴中制成50%全脊髓勻漿，將含6 mg/mL卡介苗的弗氏完全佐劑與全脊髓勻漿等體積混合并于冰浴中制成油包水型免疫抗原。

1.4 實驗動物分組及模型制作 將30只Wistar雌性6周齡大鼠隨機分為正常對照組、佐劑對照組及EAE模型組，每組10只。正常對照組大鼠常規飼養。佐劑對照組及EAE模型組則于大鼠雙足側足墊分別注入弗氏完全佐劑與免疫抗原（2 mL/ kg），其余處理同正常對照組。

1.5 臨床癥狀的觀察及數據的記錄 自造模當日起每日上、下午定時由同一人員通過觀察大鼠行為學變化并采用Correa評分標準[1]進行神經功能障礙評分，記錄各組大鼠發病情況。其中大鼠神經功能障礙評分≥1分視為臨床發病。

1.6 實驗終止 于EAE大鼠發病高峰期（大鼠神經功能障礙評分連續3 d無增加或大鼠處于瀕死狀態、對外界刺激無反應或死亡）終止實驗。已予抗原處理而未發病大鼠及正常對照組大鼠分別均于觀察1個月后處死。

1.7 大鼠腦組織中PGE2含量測定 石蠟切片常規脫蠟并水化。經消除內源性過氧化物酶活性及加熱修復抗原、滴加5%正常山羊血清封閉處理后，分別滴加一抗（以1︰500稀釋）、生物素標記的二抗（山羊抗兔IgG）及辣根酶標記的鏈霉卵白素，采用二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。高倍光學顯微鏡（10×40）下觀察大鼠腦組織PGE2陽性表達情況，胞漿呈棕黃色為陽性細胞。免疫組化圖片中PGE2的平均光密度值，采用Image Pro Plus軟件分析，對PGE2表達進行半定量測定。

1.8 統計學方法 SPSS 17.0統計軟件包完成統計分析。計量資料用“x±s”表示，采用完全隨機設計資料的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。Pearson直線相關用于變量間相互關系的分析。

2 結果

2.1 臨床表現 正常對照組及佐劑對照組大鼠均未發病。EAE模型組大鼠均急性發病，發病潛伏期為（8.55±0.84）d，發病進展期為（10.02±0.59）d，發病高峰期神經功能障礙評分為（3.84±0.41）分。發病大鼠開始時多表現為活動及進食量減少、反應遲鈍，此后又漸出現抬尾無力、肢體癱瘓，嚴重者表現為尾巴及四肢癱瘓拖地，后肢雙足跖面向上，抬頭無力甚至呈瀕死狀態并最終死亡大鼠1只。

2.2 各實驗組大鼠腦組織PGE 2的表達 光鏡下觀察，PGE 2在EAE模型組大鼠腦組織中均可見不同程度表達，表達細胞以星形膠質細胞為主，胞質內可見棕黃色顆粒（見圖1）。佐劑對照組及正常對照組則未見PGE 2陽性細胞（見圖2）。

圖1 EAE 對照組大鼠腦組織內PGE 2表達呈強陽性（HE×400）

圖2 正常對照組大鼠腦組織內未見PGE 2表達（HE×400）

正常對照組及佐劑對照組大鼠腦組織中PGE2平均光密度值均為0，EAE模型組大鼠腦組織中PGE2平均光密度值為（0.55±0.06）。

2.3 EAE模型組大鼠腦組織中PGE2含量與臨床表現的相關性分析 EAE模型組大鼠腦組織中PGE2含量與發病潛伏期呈負相關（r=-0.960，P＜0.01），與發病進展期及發病高峰期神經功能障礙評分呈正相關（分別為r=0.908，P＜0.01；r=0.888，P＜0.01）。

3 討論

有研究表明，Th 1及Th 17細胞具有促進MS及EAE疾病進展的作用。Th 1細胞可通過分泌TNF-α上調血腦屏障（blood-brain barrier，BBB)中內皮細胞間黏附分子-1的表達，促進T淋巴細胞的活化[2]，破壞BBB的穩定性，使CNS內T淋巴及巨噬細胞增多，介導病變發生[3]。Th 17細胞則在EAE病程中大量增殖并分泌INF-γ、TNF-α、IL-17[4]等細胞因子進一步促進炎癥級聯反應，加重病情。有研究表明，阻斷IL-17所介導的信號通路可緩解EAE病情[5]。因此，在EAE疾病的發生發展中，T細胞，尤其是Th 1、Th 17細胞在病情的衍變過程中發揮著重大作用。

PGE2是花生四稀酸經花生四稀酸環氧酶及PGE2合酶催化作用的產物，調節機體的炎癥反應及細胞的生長、分化、凋亡等眾多生理病理過程。Pollak等[6]的研究表明，EAE動物發病除與腦組織中炎性細胞的浸潤及炎性因子的表達相關，還與PGE2的生成增多相關。通過作用于抗原提呈細胞表面的EP2及EP4受體，PGE2不僅可使IL-23和IL-6分泌增加進而促進Th 17細胞的分化與表達，還可促使CD 4+T細胞向Th 1細胞分化[7]。與此同時，PGE2作為炎性反應促進因子還可導致IL-12、IL-6及TNF等生成增多[8]，促進EAE病情的發展。PGE2的EP 4受體特異性拮抗劑則可抑制Th 1細胞及Th 17細胞增殖從而抑制EAE的病理過程[9]。在關于人工合成的類維生素A治療EAE疾病的研究中，抑制PGE2的合成便是其作用機制之一[10]。因此，PGE2在EAE疾病的發生發展中所起的作用不容忽視。

本實驗通過對大鼠腦組織中PGE2表達情況的檢測，結果顯示，正常對照組及佐劑對照組無表達，EAE模型組大鼠發病高峰期腦組織中PGE2表達明顯增加，提示PGE2在EAE疾病的衍變過程中可能發揮了作用，與國外相關研究報道相符。相關性分析提示，PGE2含量與發病潛伏期呈負相關（P＜0.01），與發病進展期及發病高峰期大鼠神經功能障礙評分呈正相關（P＜0.01），再次提示PGE2與EAE疾病的發生發展可能相關。

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Objective To detect the expression of prostaglandin E2(PGE2) in the brain tissue of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and investigate the effect of PGE2on EAE. Methods Thirty female Wistar rats were randomly divided into three groups according to the randomly digital table: normal control group,EAE control group and adjuvant group. The complexes of the guinea pig spinal cord homogenate (GPSCH) and the complete FrReud’s adjuvant (CFA) were used in the induction of the Wistar rat model of EAE. The latency,progression and scores of symptoms were recorded. The expressions of PGE2in the brain tissue were detected by the immunohistochemistry technique and the staining intensities of PGE2were semiquantitatively analysised with the ImagePro Plus. Results No rats in the normal control and adjuvant group were ill while rats in the EAE control group were just opposite. Compared with the normal control and adjuvant group,there were significantly obvious expressions of PGE2in EAE control. The expressions of PGE2were negatively correlated with the latencies of this disease while positively correlated with the progressions and the scores of symptoms in the peak time of this disease. Conclusion PGE2might play arole in the development of EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis;Prostaglandin E2;Multiple sclerosis;Th 1;Th 17

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.8.002

四川 644000 宜賓市第一人民醫院神經內科 （黃蕾 彭仕軍 羅章坤） 瀘州醫學院附屬醫院神經內科 （李作孝）

李作孝 E-mail:lzx 3235@sina.com