南方紅豆杉組織培養體系優化

郄亞微

(廣安職業技術學院建筑與城市規劃系，四川 廣安 638000)

?

南方紅豆杉組織培養體系優化

郄亞微

(廣安職業技術學院建筑與城市規劃系，四川 廣安 638000)

[摘要]為建立南方紅豆杉(Taxus chinensis)愈傷組織的高效誘導體系，提高紅豆杉愈傷組織的誘導率和成活率，分別對南方紅豆杉愈傷組織誘導的培養基、外植體接種方法、植物生長調節劑、pH進行優化試驗，結果得出：最適宜的培養基為B5改良型、最佳接種方法為無葉莖段正插入培養基、添加2.0mg/L2，4-D或1.0mg/LNAA、pH控制在6左右，可以分別有效地提高紅豆杉愈傷組織的誘導率和成活率。

[關鍵詞]南方紅豆杉(Taxus chinensis)；組織培養；愈傷組織；優化

紅豆杉(Taxuschinensis)是一種珍稀的裸子植物，具有非常重要的藥用價值和經濟價值，其富含的紫杉醇是有效的癌癥治療藥物，近年來隨著對紫杉醇的需求增加，傳統的種植方式提供的紫杉醇已經無法滿足目前藥用的需要。如何采用科學的方法對紅豆杉組織進行快速培養和大量生產，以大量獲得紫杉醇，滿足藥用需求，成為了目前醫療藥材生產中急需解決的問題[1]。

植物組織培養技術是指在無菌的條件下，將植物組織置于培養基內，并將培養基放置到適宜的環境中進行連續的培養得到新的組織[2]，這種技術非常適合大批量的生產和培育特定的植物組織和幼苗，被廣泛地應用于生物、農業和醫藥等科技領域的相關研究中。早在20世紀中期美國就采用組織培養技術成功地取代了傳統的種植繁殖培育出了芹菜幼苗[3]，并且在后續研究中成功地應用到多種植物的幼苗和組織培養中，給農業育種帶來了革命性的變化[4]。到20世紀末，德國和日本就已經利用植物組織培養技術生產次生代謝物，這一技術后來被廣泛應用于各種稀有植物類藥物的生產，極大地降低了稀有藥物的價格，有效地促進了醫藥生物技術的發展和進步[5]。植物組織培養技術被應用到紫杉醇大批量生產中，可有效地解決紫杉醇的藥用需求問題[6]。但是從目前來看，在采用植物組織培養技術進行紅豆杉組織培養生產紫杉醇的過程中，由于培養基的問題，使得實際生產過程中紅豆杉的組織的成活率和誘導率往往較低，給紫杉醇產量的提升帶來了嚴重的阻礙[7]。

為此，本研究在傳統的培養基體系基礎上對其進行優化，以建立南方紅豆杉愈傷組織高效誘導體系，提高紅豆杉愈傷組織的誘導率和成活率，這對提高紫杉醇產量和質量具有非常重要意義。

1材料與方法

1.1材料

本研究中各試驗使用的外植體材料類型如表1所示。

表1　各試驗中使用的外植體類型

1.2方法1.2.1不同類型培養基的誘導愈傷組織試驗

選取長勢基本一致的新生南方紅豆杉新生枝條和葉片組織，首先用中性洗滌劑去除其表面的灰塵，并用無菌蒸餾水清洗4～5次，用濾紙將其表面的水分吸干后再用75%的酒精對其進行殺菌消毒處理，消毒時長為1min，然后用0.1%的HgCl2對其進行消毒，消毒時間12min，再用無菌蒸餾水對其進行清洗5～6次，將組織切成2～5cm的莖段和1.5～2cm的切片，將外植體接種到B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE6種培養基中進行暗培養，培養環境溫度為25℃，每組培養基接種100個莖段或者切片，在培養過程中按文獻[8]的方法進行觀察記錄。

1.2.2不同組織的接種方法的誘導愈傷組織試驗

選取長勢基本一致的南方紅豆杉的新生枝條和葉片組織，采用前述試驗中的消毒處理方法進行處理后，將新生枝條和葉片組織處理成1～1.5cm的組織切面，接種于含有B5改良型培養基的三角瓶中進行暗培養，培養的環境溫度為25℃。其中6種不同的接種方法如圖1所示，每種接種方法接種100個，在培養過程中記錄愈傷組織的誘導數和可繼代愈傷組織數，并對紅豆杉組織細胞進行評價。

圖1　不同接種方法示意圖

1.2.3調節劑對愈傷組織誘導及增殖影響試驗

選取長勢基本一致的紅豆杉枝條組織，采用前述試驗相同的消毒處理方法對其進行處理，切段接種于含有0.002mg/L TDZ、0.5mg/L 2，4-D、1.0mg/L 2，4-D、2.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、1.0mg/L NAA、0.5mg/L KT、1.0mg/L KT的B5改良型培養基的三角瓶中進行暗培養，環境溫度為25℃，記錄1個繼代周期的組織細胞增重、褐化率，對細胞進行評價。

因為PBL教學模式一般都是以小組的形式開展，所以，將學生進行合理地小組劃分是最為關鍵的基礎環節。小組劃分應該以激發學生的參與積極性和主動性為基礎，促使學生主動完成規定任務。教師則應對學生的英語口語水平進行綜合評判，并根據水平差異進行小組劃分，防止整體實力過強或者過弱。這樣一來，才可以進一步避免在討論的時候，出現強勢或弱勢極端群體。同時，教師還應在小組中，指定一名同學作為組長，負責小組成員的具體任務劃分，并對小組成員的活動與討論參與性進行實時監督。這就需要小組組長既具備良好的英語口語水平，又要具有一定的組織與管理能力。

1.2.4pH對愈傷組織誘導及增殖的影響試驗

選取長勢基本一致的南方紅豆杉新生枝條，采用前述試驗中相同的消毒方法，將其切片接種于pH為7.5、7、6.5、6、5.5的B5改良型培養中進行暗培養，培養的環境溫度為25℃，每組培養基接種100個切片，培養30d時，記錄愈傷組織的誘導數和可繼代數。

1.3紅豆杉組織細胞的生理評價

根據前期的預試驗的觀察和數據分析，本研究將南方紅豆杉愈傷組織的顏色進行分級，分為5個顏色度，如圖2所示。

1.白綠色，細胞透明、呈現玻璃狀；2.白黃色，細胞較為透明；3.黃色，細胞不透明；4.深黃色，小部分褐化現象；5.土黃色，大部分褐化現象圖2　紅豆杉細胞顏色等級

對組織的細胞質地按照如圖3所示的觀測到的組織細胞分布來進行評價。

1.細胞松散，有水質細胞粘連；2.細胞松散，細胞含水量較高，細胞不粘連；3.細胞均勻，蓬松，細胞呈沙粒狀聚集；4.細胞緊密，水份較低；5.細胞結塊，缺水圖3　紅豆杉細胞質地等級

分析過程中采用如下計算公式對組織的可繼代愈傷組織率、褐化率和細胞鮮重進行度量和計算，進而通過這3個指標參數來判斷細胞的生理指標：

可繼代愈傷組織率=(可繼代細胞的質量/誘導愈傷組織質量)×100%

細胞鮮重=單位時間內細胞增加的質量(g)

2結果與分析

2.1不同類型培養基對愈傷組織誘導的影響

由表2可以看出，在不同類型培養基的愈傷組織的誘導試驗中，誘導率從大到小分別為B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE，可繼代細胞大小由大到小分別為B5改良型、B5、MS、SH、WPM、WHITE，B5改良型的培養基的愈傷組織誘導周期最短，細胞質地均勻，可繼代細胞數目最多，B5改良型培養基顯著優于其他類型培養基，更適合紅豆杉組織的培養。

表2　不同類型培養基誘導愈傷組織的試驗結果

2.2不同組織的接種方法對誘導愈傷組織的影響

由表3可以看出：在6種接種方法中，方法1、2和3的誘導率和可接種率都達到了100%；從時間上看，方法3的愈傷出現時間最長為11d，方法1的時間最短為8d，顏色和質地都一致；但從污染率上看，方法3具有明顯的優勢，只有1%的污染率。綜合考慮，采用方法3無葉莖段進行接種可以有效地提高紅豆杉組織培養的誘導率和可接種率，且污染率低，是最適合南方紅豆杉愈傷組織誘導的接種方法。

表3　不同組織接種方法誘導愈傷組織試驗結果

2.3調節劑對愈傷組織誘導及增殖的影響

調節劑對愈傷組織誘導及增殖影響試驗得出的結果如表4所示。由表4可以看出，2,4-D、NAA的影響最為明顯，2，4-D、NAA濃度越高愈傷組織的誘導率越高，細胞的質地也越好，愈傷組織的細胞可繼代率越高，因此，在構建紅豆杉組織培養體系中可通過添加2.0mg/L 2，4-D或1.0mg/LNAA進行調節，可以有效地改善細胞的質地、誘導率和可繼代率。

表4　調節劑對愈傷組織誘導及增殖的影響試驗結果

2.4pH對愈傷組織誘導及增殖的影響

由表5可以看出，在pH為6時南方紅豆杉愈傷組織的誘導率和可繼代率都較高。因此，在構建紅豆杉培養體系中，pH應當控制在6左右。

表5　pH對愈傷組織誘導及增殖的影響試驗結果

3結語

紅豆杉作為提取紫杉醇藥物的一種重要的植物，采用植物組織培養技術對其進行培養，是目前實現大批量的生產紫杉醇藥物的最佳途徑，是醫藥領域對紫杉醇需求的保障。本研究通過不同類型培養基的愈傷組織的誘導試驗、不同組織的接種方法的誘導愈傷組織試驗、調節劑對愈傷組織誘導及增殖影響試驗和不同pH對愈傷組織誘導及增殖的影響試驗，篩選出了適宜南方紅豆杉愈傷組織誘導、組織細胞增殖的培養條件，從培養基的組成成分、生長調節劑、pH和接種方法4個方面建立了南方紅豆杉愈傷組織高效誘導體系，可以有效地提高紅豆杉愈傷組織誘導率和成活率，對提高紫杉醇生產效率具有非常重要的意義。

[參考文獻]

[1]周玉潔.東北紅豆杉與美麗鐮刀菌的固定化法共生培養[D].無錫：江南大學,2008.

[2]趙晶.東北紅豆杉細胞培養高效提取紫杉醇技術體系研究[D].長春：吉林大學,2014.

[3]劉麗麗.東北紅豆杉開放式組培育苗關鍵技術研究[D].長春：吉林大學,2013.

[4]袁麗娜.東北紅豆杉工廠化育苗生產模式優化及技術體系的構建[D].長春：吉林大學,2014.

[5]凡利.南方紅豆杉細胞懸浮培養產紫杉醇的研究[D].長沙：中南林業科技大學,2012.

[6]杜亞填.南方紅豆杉愈傷組織培養及其紫杉醇含量調控的優化研究[D].長沙：湖南農業大學,2006.

[7]胡新玲.紅豆杉紫杉烷14β-羥基化酶基因植物表達載體的構建及轉化的研究[D].北京：中國林業科學研究院,2007.

[8]翟雪霞,楊靖,李友勇.紅豆杉高產細胞系快速建立和更新的新方法[J].生物技術通訊,2009,(3):376～379.

[收稿日期]2015-11-09

[基金項目]四川省教育廳科研項目(14ZB0390)。

[作者簡介]郄亞微(1981-)，女，碩士，講師，現主要從事園林植物生物技術研究，snowy5568@sina.com。

[中圖分類號]Q813.1+2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)09-0042-04

[引著格式]郄亞微.南方紅豆杉組織培養體系優化[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(9)：42～45,49.