費約果葉片總黃酮的提取工藝研究

馬澤剛，袁小紅，*，徐春霞，劉卓，王丹，徐文學(xué)，張新堯（.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽6000；.樂山同泰生物科技有限公司，四川樂山64000；.樂山市農(nóng)業(yè)局，四川樂山64000）

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費約果葉片總黃酮的提取工藝研究

馬澤剛1，袁小紅1，*，徐春霞1，劉卓1，王丹1，徐文學(xué)2，張新堯3
（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621000；2.樂山同泰生物科技有限公司，四川樂山614000；3.樂山市農(nóng)業(yè)局，四川樂山614000）

摘要：研究費約果葉片總黃酮提取工藝，優(yōu)選最佳提取條件。以提取率、總黃酮收率和總黃酮純度為指標(biāo)，采用單因素試驗法，考察提取溶劑、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對費約果總黃酮收率的影響，再進(jìn)行正交試驗，優(yōu)選出最佳提取工藝條件。最佳總黃酮提取工藝：90℃條件下，將費約果葉片粉用水回流提取3次，每次2 h，料液比分別為第1次1∶10（g/mL），第2次、第3次料液比為1∶5（g/mL）。提取率、總黃酮收率、總黃酮純度分別為：16.23%、6.90%、42.51%。

關(guān)鍵詞：費約果；葉片；總黃酮；提取

費約果（Feijoa sellowiana Berg.）又名鳳梨番石榴、巴西番石榴、無花果番石榴，系桃金娘科費約果屬常綠灌木或小喬木。費約果果實主要化學(xué)成分包括維生素E、黃酮、豆甾醇、β-胡蘿卜素、對羥基苯乙醇和多酚類成分［1］。費約果葉片具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫和抗炎等藥理作用［2-6］，費約果葉片中含有豐富的黃酮物質(zhì)。研究表明，黃酮類化合物能防治心腦血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，具有抗炎抑菌、降低血糖以及增強(qiáng)免疫功能等藥理作用［7-8］。目前對費約果葉片總黃酮提取工藝研究的文獻(xiàn)報道較少。本文以提取率、總黃酮收率、總黃酮純度為指標(biāo)，采用單因素試驗比較了不同提取因素對費約果葉片總黃酮提取的影響，并進(jìn)行了正交試驗設(shè)計優(yōu)化，以期為費約果葉片的開發(fā)利用提供了理論參考和試驗指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

費約果葉片：由四川樂山同泰生物科技有限公司提供；所用試劑均為國產(chǎn)分析純；水為超純水。

S54型紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；KQ5200B型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品25 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。量取20 mL，置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，制成每1 mL中含無水蘆丁0.2 mg的溶液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

量取對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL容量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外分光光度法，在500 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 11.546x-0.001 1（r=0.999 6）。

1.2.3供試品溶液的配制

取費約果葉片粉末（60目）5 g，至圓底燒瓶中，按試驗設(shè)計安排進(jìn)行回流提取。抽濾，濾渣用水洗滌，合并并濃縮濾液，置于10 mL容量瓶中，定容，搖勻，得供試品溶液。

1.2.4樣品測定

吸取供試品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。量取2 mL，置于25 mL容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外分光光度法，在500 nm波長處測定吸光度。

1.2.5單因素試驗

1.2.5.1提取溶劑的選擇

按“1.2.3”項方法提取總黃酮，提取溶劑分別用70%乙醇，pH 8 NaOH溶液，水作為溶劑，50℃下分別提取1次，2 h，平行提取3次。按“1.2.4”項操作顯色后，測定吸光度，帶入回歸方程，測總黃酮含量，計算收率和純度。

1.2.5.2提取溫度的選擇

按“1.2.3”項方法提取總黃酮，提取溶劑為水，分別在溫度為40、50、60、70、80、90℃下提取1次，2 h。平行提取3次，按“1.2.4”項操作顯色后，測定吸光度，帶入回歸方程，測總黃酮含量，計算收率和純度。

1.2.5.3提取時間的選擇

按“1.2.3”項方法提取總黃酮，提取溶劑為水，90℃下分別提取1、2、3、4、5 h，平行提取3次，按“1.2.4”項操作顯色后，測定吸光度，帶入回歸方程，測總黃酮含量，計算收率和純度。

1.2.5.4提取次數(shù)的選擇

按“2.3”項方法提取總黃酮，提取溶劑為水，90℃下分別提取1、2、3次，每次4 h，平行提取3次。按“1.2.4”項操作顯色后，測定吸光度，帶入回歸方程，測總黃酮含量，計算收率和純度。

1.2.6正交試驗

正交試驗因素和水平的確定：根據(jù)單因素初篩試驗結(jié)果，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為因素，以總黃酮收率為指標(biāo)，選用L9（34）正交表設(shè)計，因素水平見表1。

表1　因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.7驗證試驗

按正交試驗結(jié)果確定的最佳工藝方案，重復(fù)提取費約果葉片3次。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1提取溶劑對費約果葉片總黃酮提取的影響

提取溶劑對提取總黃酮的影響見表2。

表2　提取溶劑對提取總黃酮的影響Table 2 Effects of extraction solvent on the extraction rate of total flavonoids

結(jié)果表明按總黃酮收率的大小順序為水＞pH 8的NaOH溶液＞70%乙醇，純度差異不大，且水提取率較大，綜合收率和純度來考慮，確定用水作為提取溶劑。

2.1.2提取溫度對費約果葉片總黃酮提取的影響

提取溫度對提取總黃酮的影響見表3。

結(jié)果表明，隨著提取溫度的增加，總黃酮收率基本成上升趨勢，純度變化不大，綜合收率和純度來考慮，確定提取溫度為90℃。

表3　提取溫度對提取總黃酮的影響Table 3 Effects of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3提取時間對費約果葉片總黃酮提取的影響

提取時間對提取總黃酮的影響見表4。

表4　提取時間對提取總黃酮的影響Table 4 Effects of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

結(jié)果表明，在1 h～4 h內(nèi)，隨著提取時間的增長，總黃酮收率成上升趨勢，純度變化不大，綜合收率和純度來考慮，確定提取時間為4 h。

2.1.4提取次數(shù)對費約果葉片總黃酮提取的影響

提取次數(shù)對總黃酮提取的影響見表5。

表5　提取次數(shù)對總黃酮提取的影響Table 5 Effects of extraction times on the extraction rate of total flavonoids

結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)增加，提取率、總黃酮的收率，純度在增加，故確定提取次數(shù)為3次。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，料液比大會增加成本，即在第1次提取時料液比為1∶10（g/mL），第2次、第3次料液比為1∶5（g/mL）。

2.2正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表6。

表6　正交試驗結(jié)果Table 6 Results of L9（34）orthogonal test

結(jié)果表明：按總黃酮的收率為主要指標(biāo)考慮，影響因素的主次順序：C（提取次數(shù)）＞A（提取溫度）＞B（提取時間）；從各因素水平對總黃酮收率的影響來看（k值分析），A因素為k3＞k2＞k1，B因素為k1＞k3＞k2，C因素為k3＞k2＞k1。根據(jù)以上直觀分析結(jié)果，費約果葉片總黃酮提取最佳工藝為A3B1C3。本研究旨在應(yīng)用于實際生產(chǎn)當(dāng)中，考慮到生產(chǎn)中料液比增大會增加成本，所以結(jié)合前期預(yù)試驗，將料液比已設(shè)定為第1次提取時料液比為1∶10（g/mL），第2次、第3次料液比為1∶5（g/mL）。最終確定總黃酮提取工藝為A3B1C3，即90℃條件下，水回流提取3次，每次2 h，料液比分別為第1次1∶10（g/mL），第2次、第3次1∶5（g/mL）。提取率、總黃酮收率、總黃酮純度分別為：16.23%、6.90%、42.51%。

2.3工藝驗證結(jié)果

按正交試驗結(jié)果確定的最佳工藝方案，重復(fù)提取費約果葉片3次，RSD=1.40%，3次差異較小，工藝穩(wěn)定，可行。工藝驗證結(jié)果見表7。

表7　工藝驗證結(jié)果Table 7 Verification of test results

3　結(jié)論

通過對費約果葉片總黃酮提取工藝的單因素試驗和正交試驗分析，確定了最佳費約果葉片總黃酮的提取工藝為：90℃條件下，將費約果葉片粉用水回流提取3次，每次2 h，料液比分別為第1次1∶10（g/mL），第2次、第3次料液比為1∶5（g/mL）。正交試驗設(shè)計的數(shù)據(jù)分析表明，提取次數(shù)、提取溫度是顯著影響因子，提取時間是不顯著因子，為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，減小成本，即在第2次、第3次提取時料液比縮小。驗證結(jié)果與預(yù)測結(jié)果接近，表明該提取工藝穩(wěn)定，可行。

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Extraction Technology of Total Flavonoids from Leaves of Feijoa sellowiana Berg.

MA Ze-gang1，YUAN Xiao-hong1，*，XU Chun-xia1，LIU Zhuo1，WANG Dan1，XU Wen-xue2，ZHANG Xin-yao3
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621000，Sichuan，China；2. Leshan Tongtai Bio-technology Co.，Ltd.，Leshan 614000，Sichuan，China；3. Leshan Bureau of Agriculture，Leshan 614000，Sichuan，China）

Abstract：The optimal extraction technology of total flavonoids from the leaves of Feijoa sellowiana Berg. was studied. Taking extraction rate，and the purity and yield of total flavonoids as the indices，effects of extraction solvent，extraction temperature，extraction time，and extraction times on the extraction rate of total flavonoids were studied．And the optimal extraction technology was selected. The optimal extraction technology was as follow：under 90℃，leaves of Feijoa sellowiana Berg. powder was by reflux extraction in water for 3 times with each time for 2 h. The ratio of sample to extraction solution 1∶10（g/mL）for the first time，and 1∶5（g/mL）for the second time and third time. The extraction rate，extraction rate of total flavonoids，and purity of total flavonoids were 16.23%，6.90%and 42.51%，respectively.

Key words：Feijoa sellowiana Berg.；leaves；total flavonoids；extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.018

作者簡介：馬澤剛（1989—），男（回），碩士研究生，主要從事天然藥物化學(xué)研究工作。

*通信作者：袁小紅（1974—），男（漢），教授，博士，主要從事天然藥物化學(xué)研究工作。

收稿日期：2015-03-17