油茶籽殼總黃酮對黃曲霉毒素B1致肝細胞氧化應激的保護作用及機制

汪秀+李菲+黃利輝

摘要：研究油茶籽殼總黃酮（CSF）對黃曲霉毒素B1（AFB1）誘導的人肝細胞（HL-7702）氧化應激的保護作用及其機制。以20 μg/mL AFB1處理2 d建立HL-7702細胞AFB1損傷模型；與AFB1損傷組比較，25、50、100 μg/mL CSF預處理HL-7702細胞1 d，細胞存活率顯著上升（P<0.05），細胞內活性氧（ROS）和脂質過氧化物丙二醛（MDA）水平顯著下降（P<0.05），超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著升高（P<005），核因子E2相關因子2（Nrf2）及其下游谷胱甘肽S轉移酶A2（GSTA2）的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），核轉錄因子κB（NF-κB）及下游炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的mRNA表達顯著下降（P<0.05）。因此，油茶籽殼總黃酮通過上調Nrf2，提高Nfr2下游抗氧化酶系的活性，阻斷了由ROS引起的脂質過氧化鏈式反應，同時下調NF-κB，減少炎癥因子相關基因的表達，從而拮抗AFB1對肝細胞的毒性損傷，提高了肝細胞存活率。

關鍵詞：油茶籽殼；總黃酮；黃曲霉毒素B1；氧化應激；細胞保護

中圖分類號： R284.1

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0308-04

由黃曲霉、寄生曲霉產生的黃曲霉毒素B1（AFB1）經常被發現于發霉變質的飼料、食物中，被認為是中毒性最強、危害最大的一種霉菌毒素[1]。生物體攝入AFB1后，在不同器官誘發產生細胞內活性氧（ROS），破壞機體的氧化-抗氧化平衡，從而使脂質過氧化物丙二醛（MDA）積累，對脂類、蛋白質、DNA等生物大分子造成損傷[2]，由此形成的氧化應激對肝臟的損傷是最大的[3]。研究表明，植物黃酮類物質能吸收包括AFB1在內的多種霉菌毒素，減輕其對動物體的損傷，保護肝臟，從而改善牲畜健康，提高畜產品產量。人參皂苷[4]、槲皮苷[5]、柚皮苷[6]、藤黃雙黃酮[7]等都被發現具有黃曲霉毒素細胞保護作用。然而，至今仍然沒有一種商業化的AFB1生物保護劑，主要是由于上述具有細胞保護作用的化合物來源十分有限，價格昂貴。因此，尋找易獲得、廉價的此類化合物來源（如農副產品）十分必要。我國是世界上油茶籽產量最大的國家，油茶籽殼是油茶籽榨油前除去的種皮，大量的廢棄茶籽殼一般被丟棄或用作燃料，既污染環境又浪費資源。研究表明，油茶籽殼中含有豐富的黃酮類物質[8]，關于這類黃酮類物質提取工藝的研究已經很多，但對其功能研究目前僅局限在證明其具有較好的體外抗氧化性能[9-10]。因此，筆者推測油茶籽殼中的黃酮類物質所具有的抗氧化能力可以減輕AFB1對細胞的毒性作用。本研究采用AFB1最易損傷的正常肝細胞HL-7702細胞為材料，建立AFB1肝細胞損傷模型，探討油茶籽殼中黃酮類物質對AFB1肝細胞損傷的保護作用及其可能機制，旨在為油茶籽殼的綜合高效利用和天然AFB1生物保護劑開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 油茶籽殼總黃酮（CSF）樣品制備

油茶籽購自浙江省嘉興市農貿市場，剝殼后自然曬干即得油茶籽殼，粉碎后備用。取5 g油茶籽殼粉碎樣品，依照姜天甲等[9]和高揚等[11]的方法，按1 g ∶30 mL比例加入60%乙醇溶液，浸泡30 min，40 ℃超聲波提取45 min，濾液減壓濃縮后加蒸餾水定容至50 mL，加等體積石油醚充分振蕩，靜置分層后分離收集，經40 ℃真空減壓旋轉蒸發后，制備得油茶籽殼總黃酮并用DMSO配成20 mg/mL儲備液，-20 ℃保存。

1.2 材料

人正常肝細胞系HL-7702購于中國科學院上海細胞庫；AFB1、DMSO、MTT均為Sigma公司產品，AFB1溶解于DMSO 中，配成1 mg/mL母液；RPMI-1640培養基、胰酶、青鏈霉素均為HyClone公司產品；胎牛血清購于四季青公司；MDA試劑盒，SOD、CAT、GSH-Px測定試劑盒購于南京建成工程研究所；ROS檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PCR試劑盒、TRIzol、脫脂牛奶（BSA）均為碧云天公司產品；PrimeScript RT反轉錄試劑盒購于TaKaRa公司；小鼠抗人Nrf2、GSTA2、β-actin單克隆抗體均為Santa Cruz公司產品；HRP標記的山羊抗小鼠IgG購于武漢博士德生物公司；PCR引物均合成自上海博尚生物公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 人HL-7702正常肝細胞以RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清、1%雙抗）于37 ℃、5%CO2培養。

1.3.2 AFB1致HL-7702細胞損傷模型建立 采用MTT法檢測HL-7702細胞增殖抑制率，試驗分為對照組和AFB1組。HL-7702細胞按5 000個細胞/孔接入96孔板中，每組設5個復孔，過夜培養待細胞貼壁后加化合物。對照組每孔加入含1%DMSO的完全培養基100 μL，AFB1組每孔加入含5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL AFB1的完全培養基100 μL。各組分別培養0.5、1、2 d后棄去孔內培養基，并加入100 μL含 MTT溶液（終濃度0.5 mg/mL）的無血清培養基，避光37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加100 μL DMSO，振蕩使結晶物充分溶解，570 nm下測定各孔吸光度，細胞抑制率=（D對照-D試驗）/ D對照×100%。根據MTT結果，選擇AFB1的最佳濃度進行后續試驗。

1.3.3 油茶籽殼總黃酮對AFB1致細胞損傷的預保護試驗 細胞接板和MMT檢測方法同“1.3.2”節，試驗分組如下：設正常對照組、AFB1模型組和油茶籽殼總黃酮低劑量、中劑量、高劑量保護組。正常對照組：細胞先用含1%DMSO（CSF的溶劑）的完全培養基培養1 d，換液后再加入含1%DMSO（AFB1的溶劑）的完全培養基繼續培養2 d；AFB1模型組：細胞先用含1%DMSO（CSF的溶劑）的完全培養基培養1 d，換液后加入含有最佳損傷濃度AFB1（20 μg/mL）的完全培養基繼續培養2 d；CSF保護組：細胞先分別與含25、50、100 μg/mL CSF的完全培養基預孵1 d，換液后加入含有最佳損傷濃度AFB1（20 g/mL）的完全培養基繼續培養2 d。3 d培養結束后檢測細胞存活率，細胞存活率計算公式如下：

細胞存活率=D試驗/ D對照×100%。（1）

1.3.4 HL-7702細胞內MDA生成量的檢測 采用 “1.3.3”節所述方法處理HL-7702細胞，用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA含量[12]。將各組細胞裂解后按照試劑盒說明書操作步驟進行操作，在532 nm處測定各孔吸光度，采用BCA試劑盒說明書規定的方法測定總蛋白濃度。

1.3.5 HL-7702細胞內ROS水平的檢測 采用 “1.3.3”節所述方法處理HL-7702細胞，采用二氯熒光素雙乙酸（DCFH-DA）法測定細胞內ROS水平。將各組細胞裂解后按照試劑盒說明書操作步驟進行，細胞裂解液與10 nmol/L DCFH-DA 37 ℃孵育30 min后，PBS洗細胞2次。熒光強度用熒光酶標儀以激發波長485 nm 和發射波長535 nm檢測。ROS相對含量計算公式如下：

ROS相對含量=處理組熒光強度/對照組熒光強度×100%。（2）

1.3.6 HL-7702細胞內抗氧化酶系含量測定 采用 “1.3.3”節所述方法處理HL-7702細胞，收集各組細胞，用冰PBS洗，然后在冰上用超聲破碎機200 V、30 s，間隔5 s，3次破碎細胞，取100 L細胞裂解液，按照試劑盒說明書操作步驟測定SOD、CAT、GSH-Px酶活性。酶活性以酶比活力單位（U/mg）表示，并用細胞總蛋白質含量作校正。

1.3.7 RT-PCR檢測相關基因的改變 采用 “1.3.3”節所述方法處理HL-7702細胞，收集各組細胞，提取細胞總RNA，采用PrimeScript RT反轉錄試劑盒并進行逆轉錄，得到各組細胞cDNA。PCR擴增條件均為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min；循環數30。最后PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，檢測基因引物見表1，GAPDH為內參。

1.3.8 Western blot檢測蛋白表達的改變 采用 “1.3.3”節所述方法處理HL-7702細胞，收集細胞，用PBS洗滌3次，加入裂解液，冰上充分裂解1 h，總蛋白樣品進行SDS-PAGE分離，轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用稀釋的Nrf2、GSTA2和標準內參β-actin一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加稀釋的二抗室溫孵育2 h，加ECL發光試劑，顯影、定影。

1.3.9 統計學分析 所有試驗均重復3次，數據采用x±s表示，采用SPSS 18.0軟件統計分析，采用Duncans檢驗多重比較。

2 結果與分析

2.1 HL-7702細胞AFB1受損模型的建立

由圖1可見，AFB1對HL-7702的細胞毒性呈現出劑量和時間依賴性。0.5、1 d組各濃度雖也可以明顯抑制細胞增殖，但彼此之間差異不大，2 d組各濃度對應的細胞抑制率之間差異明顯，且濃度與抑制率之間相關性好（r2=0.99），因此以2 d組數據確定AFB1的IC50濃度為20 μg/mL，以 此 作 為AFB1對HL-7702細胞損傷模型的最佳濃度。

2.2 油茶籽殼總黃酮對AFB1損傷的HL-7702細胞存活率的影響

將未經油茶籽殼總黃酮預處理的HL-7702細胞暴露于20 μg/mL AFB1 2 d，與對照組相比，細胞存活率明顯下降（表2）。經25、50、100 μg/mL油茶籽殼總黃酮預保護過的HL-7702細胞再接受相同樣劑量AFB1暴露相同時間后，細胞存活率較AFB1損傷組明顯提高，且其保護效果呈顯著的劑量效應關系。油茶籽殼總黃酮對HL-7702細胞進行預處理可以有效抑制AFB1造成的細胞增殖抑制。

2.3 HL-7702細胞內ROS和MDA水平的改變

由表3可知，與對照組相比，20 μg/mL AFB1作用HL-7702細胞2 d，顯著增加了HL-7702細胞內ROS活性和MDA含量，說明AFB1造成了HL-7702細胞的氧化損傷。經25、50、100 μg/mL油茶籽殼總黃酮預處理后，受損細胞內的ROS活性逐漸降低，與AFB1損傷組相比差異顯著，MDA含量也隨著油茶籽殼總黃酮濃度升高而顯著下降。

2.4 HL-7702細胞內抗氧化酶系的改變

由表4可見，與對照組相比，20 μg/mL AFB1作用HL-7702細胞2 d，顯著降低細胞內抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，說明細胞內源性抗氧化酶系統功能失調。經25、50、100 μg/mL油茶籽殼總黃酮預處理HL-7702細胞1 d，與AFB1損傷組相比，25 μg/mL保護組沒有顯著提升HL-7702細胞內CAT、GSH-Px活性。

2.5 HL-7702細胞內Nrf2及其下游抗氧化酶表達的改變

Nrf2被稱為氧化還原敏感轉錄因子，是調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子[16]。與對照組相比，AFB1損傷組Nrf2及其下游GSTA2的mRNA（圖2-a）和蛋白表達水平（圖2-b）均明顯下調。隨著油茶籽殼總黃酮預保護濃度的提高，與AFB1損傷組相比，Nrf2及GSTA2的mRNA和蛋白表達水平都呈現劑量依賴性上調。GSTA2是Nrf2調控的下游眾多抗氧化蛋白之一，SOD、CAT、GSH-Px也受Nfr2的調控，由此可知，油茶籽殼總黃酮在細胞氧化應激的情況下，通過上調Nrf2表達，提高了其下游一系列抗氧化酶的活性，從而對抗由AFB1造成的細胞氧化損傷。

2.6 細胞內NF-κB及下游炎癥因子mRNA表達的改變

研究表明，肝細胞遭受氧化受損及肝炎、肝癌發生時NF-κB信號通路被顯著激活[17-18]。由圖3可知，與對照組相比，AFB1損傷組核轉錄因子NF-κB表達明顯上調，其相關下游炎癥介導因子TNF-α、IL-6、IL-1β也隨之高表達，隨著油茶籽殼總黃酮預保護濃度的提高，與AFB1損傷組相比，NF-κB及炎癥因子表達都呈現劑量依賴性下調。由此可知，油茶籽殼總黃酮對HL-7702細胞的預處理下調了由AFB1引起的NF-κB信號通路的激活，相關炎癥因子表達隨之減少，提示其在預防、治療肝炎方面可能具有的功能。

3 結論與討論

生物有氧代謝過程中產生的過多活性氧（ROS）會導致氧化應激，肝臟因含有豐富的線粒體，是產生ROS較多的器官，也是較易受到ROS攻擊的器官。氧化應激會引起脂質過氧化，破壞酶活性，損傷DNA，造成肝損傷。研究表明，氧化應激與多種肝臟疾病、肝功能障礙密切相關[19]。AFB1進入肝細胞后，通過環氧化反應轉變為有活性的AFB1-8，9環氧化合物，進而引發肝細胞內產生過量ROS，造成細胞的氧化應激，這是AFB1生物毒性尤其是肝臟毒性發生的主要機理[20]。

本研究表明，當肝細胞遭遇AFB1損傷時，油茶籽殼總黃酮與肝細胞的預孵顯著降低了細胞內ROS、MDA水平，同時提升了肝細胞內抗氧化酶系（SOD、CAT、GSH-Px）的活性，因此改善了肝細胞AFB1暴露下的氧化-抗氧化平衡環境，提高了細胞存活率。El-Nekeety 等[3]、 Zhang等[21]、Hou等[22]都曾報道過：當細胞暴露于霉菌毒素時，天然抗氧化劑可以增強細胞內抗氧化酶活性，阻斷脂質過氧化，從而緩解細胞的氧化應激。Nrf2是公認的細胞防御過氧化應激的重要調節因子，在氧化應激狀態下，Nrf2與細胞核內抗氧化反應元件ARE結合，上調一系列解毒酶和抗氧化蛋白表達，從而增強肝細胞的解毒及抗氧化能力，減輕活性氧（ROS）和親電子物質介導的細胞損害，對保護肝臟功能、阻止多種肝臟疾病的發生有著重要意義[23]。已經證明能通過Nrf2途徑改善肝細胞氧化應激狀態，進而發揮保護肝細胞作用的化合物有白藜蘆醇[24]、姜黃素[25]、齊墩果酸[26]、熊去氧膽酸[27] 等，這些化合物主要集中在對肝細胞的乙醇或其他藥物損傷方面的保護，由于這些化合物的來源十分有限，限制了其更為廣泛的應用。本研究表明，來自油茶籽殼中的總黃酮物質與肝細胞的預孵上調了Nrf2、GSTA2表達，GSTA2是Nrf2調控的下游眾多抗氧化蛋白之一，與肝臟解毒功能有關，SOD、CAT、GSH-Px也受Nfr2調控，抗氧化酶是細胞內對抗ROS的主要防御機制，因此可以認為油茶籽殼總黃酮預處理肝細胞后激活了Nfr2信號通路，上調其下游多種抗氧化酶基因的表達，提高細胞內抗氧化酶活性，從而對抗由ROS引起的肝細胞氧化損傷，起到保護肝細胞的作用。Costa等也報道了黃酮類物質在上調Nrf2蛋白和提高抗氧化酶活性方面的重要作用[28]。

細胞內產生過量ROS除了會導致MDA積累外，還可激活NF-κB信號通路，進而使其下游調控的許多炎癥因子（包括TNF-α等）表達增加，持續釋放，肝細胞氧化應激、凋亡，炎癥細胞大量浸潤，最終導致肝炎甚至引發肝癌[29] 。本研究表明，油茶籽殼總黃酮的預處理使得肝細胞NF-κB表達下降及其調控的炎癥因子（TNF-α、 IL-6、IL-1β）下調，這提示其在預防、治療肝炎方面可能具有的功能。油茶籽殼總黃酮通過上調Nrf2，提高Nfr2下游抗氧化酶系（SOD、CAT、GSH-Px、GSTA2）的活性，阻斷了由ROS引起的脂質過氧化鏈式反應，同時下調NF-κB，減少炎癥因子相關基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達，從而拮抗AFB1對肝細胞的毒性損傷，提高肝細胞存活率。油茶籽殼作為一種農業副產品，在我國資源豐富、價格低廉，本研究證明了其中的黃酮類物質具有拮抗AFB1肝細胞毒性的功能，為油茶籽殼的環保、高效利用提供了新途徑。

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