葡萄籽蛋白質的分離純化及電泳分析

任繼波+李敬龍+胡文效

摘要：以脫脂脫酚葡萄籽粕為原料，采用堿液浸提法對籽粕中蛋白質進行提取，確定蛋白質的最佳提取條件為溫度88 ℃、浸提液pH值11.5、料液比1 g ∶25 mL、提取時間130 min，該條件下蛋白提取率達到83.5%。結合蛋白提取液性質，設計了一套可行的葡萄籽蛋白質純化方案，初步確定了純化方案中幾個關鍵點的工藝參數。利用SDS-PAGE電泳對純化前后的樣品蛋白進行檢測分析，發現樣品蛋白中主要存在4種蛋白亞基，分子量分別為40、37、19、17 ku，純化后4種蛋白亞基占總蛋白的相對含量為91.5%。

關鍵詞：脫脂脫酚葡萄籽粕；提取；純化；電泳分析

中圖分類號： TS255.1

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0318-03

我國作為世界第7大葡萄酒生產國，2013年葡萄酒產量達11.7億 L，葡萄酒生產過程中產生的葡萄籽約5萬 t。葡萄籽是一種資源性副產物，含有豐富的脂肪、蛋白質、碳水化合物及其他活性成分[1]，其中關于葡萄籽油[2]、葡萄籽原花青素[3]利用的研究較為常見，而葡萄籽蛋白質的利用研究卻鮮有報道。脫脂脫酚葡萄籽粕中粗蛋白含量為11%～13%。檢測發現，小芒森（Petit Manseng）葡萄籽蛋白質含有18種氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，且天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸含量較高，植物中普遍缺乏的賴氨酸、精氨酸較為豐富，因此葡萄籽蛋白質在食品、飼料等領域具有較高的應用價值。本研究對葡萄籽中的蛋白質進行了提取與分離純化，并測定了蛋白亞基成分，旨在為葡萄籽的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂脫酚葡萄籽粕（粗蛋白含量11.6%），葡萄品種小芒森，產地山東省蓬萊市；有關有機、無機試劑藥品均為分析純。

UV-5200型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Kjeltec 2300型凱氏定氮儀，丹麥福斯分析儀器公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-28A型電泳儀，北京市六一儀器廠；ChampGel 5500型凝膠成像儀及分析系統，北京賽智創業科技有限公司；SHA-B型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；LNG-NF-101型實驗室膜分離設備，上海朗極膜分離設備工程有限公司；PHS-25型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；TDL-5型高速離心機，上海安亭科學儀器廠；BY-R 18型醫用離心機，北京白洋醫療器械有限公司；ML 204/2型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 測定方法 籽粕含水量測定：水分測定常規法[4]；籽粕粗蛋白測定：凱氏定氮法[5]；提取液蛋白測定：考馬斯亮藍比色法、雙縮脲法[6]；蛋白質等電點測定：等電點比色法[7]；蛋白質分子量測定：SDS-PAGE電泳。

1.2.2 脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質等電點的測定 取等量的蛋白質提取液，用2 mol/L HCl將pH值分別調為4.6、4.4、4.2、4.0、3.8、3.6、3.4、3.2、3.0、2.8、2.6、2.4、2.2，離心，測上清液中蛋白質濃度。以pH值為橫坐標，上清液蛋白濃度為縱坐標作圖，得到上清液蛋白濃度隨pH值變化的曲線圖。

1.2.3 脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質的提取

1.2.3.1 蛋白提取工藝流程 脫脂脫酚葡萄籽蛋白質的提取工藝流程見圖1。

1.2.3.2 提取條件單因素試驗 （1）浸提液pH值對提取率的影響試驗：用NaOH分別將水溶液pH值調為7.0、8.0、90、10.0、11.0，提取溫度55 ℃，料液比1 g ∶20 mL，提取時間 1.0 h。（2）料液比對提取率的影響試驗：料液比分別取1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL，提取溫度 55 ℃，pH 值11.0，提取時間1.0 h。（3）提取溫度對提取率的影響試驗：提取溫度分別設定為55、65、75、85、95 ℃，pH 值11.0，料液比1 g ∶20 mL，提取時間1.0 h。（4）提取時間對提取率的影響試驗：提取時間分別取0.5、10、15、2.0、2.5 h，提取溫度55 ℃，pH值 11.0，料液比 1 g ∶ 20 mL。

1.2.3.3 提取條件的正交試驗 在單因素試驗基礎上，采用L9（34）正交試驗設計，考察pH值、料液比、溫度、時間等4個因素（表1）對葡萄籽蛋白提取率的影響。

1.2.4 脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質的初步純化

1.2.4.1 蛋白純化工藝流程 脫脂脫酚葡萄籽蛋白質純化工藝流程見圖2。

1.2.4.2 活性炭脫色 取一定量蛋白提取液，加20 g/L顆粒狀活性炭，充分攪拌均勻后，調pH值至5.0，置于65 ℃恒溫振蕩器中保溫1 h，2層濾紙抽濾后得到清液。

1.2.4.3 鹽析—等電點沉淀 取經超濾濃縮后的提取液，用2 mol/L鹽酸溶液調pH 值至3.0，加硫酸銨并使其飽和度達80%，離心分離沉淀，對上清液繼續加硫酸銨直至飽和度達90%，離心分離沉淀。2次沉淀加少量蒸餾水使其復溶，合并復溶液，加蒸餾水調節蛋白濃度為10 g/L。

1.2.4.4 超濾濃縮、納濾脫鹽 蛋白提取液經活性炭脫色處理后，采用直徑45.7 mm的卷式有機膜元件（MWCO=10 ku）進行濃縮。工藝條件：泵頻30 Hz，運行壓力12 bar，濾出液流量7.6 L/h。濃縮過程中檢測截留液蛋白濃度，當截留液蛋白濃度為處理前蛋白液濃度的2倍時停止濃縮。濃縮液經鹽析-pI點沉淀后，采用直徑50.8 mm的卷式有機膜元件（MWCO=360 ku）進行脫鹽。工藝條件：泵頻 35 Hz，運行壓力25 bar，濾出液流量3.8 L/h，蒸餾水補加量3.8 L/h，用1% BaCl2檢查濾液中是否有SO42-存在。

1.2.5 蛋白質SDS-PAGE電泳分析 收集洗脫液，根據280 nm下的吸光度，選取蛋白濃度最高的峰進行SDS-PAGE電泳分析。電泳前，樣品采用透析法除鹽，并調節蛋白濃度為2 g/L。電泳濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，蛋白樣品與5×SDS-樣品緩沖液按體積比4 ∶1混合，100 ℃煮沸 5 min，上樣量40 μL。電泳過程中，電流控制在10 mA，待樣品進入分離膠后加大電流至20 mA，當前沿指示劑到達分離膠前沿1.0～1.5 cm時停止電泳。

2 結果與分析

2.1 脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質氨基酸組成

脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質氨基酸組成見表2。

2.2 脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質等電點的測定

由圖3可見，當蛋白提取液pH值為3.0時，離心后上清液蛋白濃度最低，因此可判斷該點為脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質的等電點，即pI=3.0。

2.3 堿液浸提法各因素對蛋白提取率的影響

由圖4可見，當pH值為10.0～11.0時，蛋白提取率快速上升，當pH值為11.0時，提取率達到36.3%。但是當pH值>11.5時，提取液顏色明顯加深，影響蛋白質含量測定。此外，pH值過高會破壞蛋白質的結構性質，使蛋白提取液散發異味。因此，選擇浸提液pH值為11.0。

由圖5可知，隨著料液比增大，蛋白提取率逐漸升高，當料液比達到1 g ∶25 mL后，提取率逐漸趨于平緩。料液比在1 g ∶20 mL至1 g ∶25 mL時，提取率增量最為顯著，因此選擇料液比為1 g ∶25 mL。

由圖6可知，在較高溫度（75～85 ℃）時，蛋白提取率增幅較大，高于85 ℃時蛋白提取率增加不明顯。這與以往報道[7]的在中溫（35～40 ℃）下蛋白提取率較高有所不同，可能是所用原料不同所造成。本研究所用葡萄籽為提取完葡萄籽油和葡萄籽原花青素之后的籽粕，而在提取葡萄籽原花青素過程中，提取劑為70%乙醇溶液，提取溫度為70 ℃[8]，此過程中高濃度乙醇和高溫使葡萄籽中原有蛋白質結構、性質發生改變，因此針對脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質的提取溫度會發生改變。綜合考慮，選擇提取溫度為85 ℃。

由圖7可知，當提取時間>2.0 h時，蛋白提取率不再隨時間延長而增加，因此選擇提取時間為2.0 h。

2.4 堿液浸提法正交試驗

從表3可見，對蛋白提取率影響最大的因素是pH值，其次是提取時間、溫度，最后是料液比。蛋白提取最佳工藝條件為A3B3C2D3，即浸提溫度88 ℃、浸提液pH值 11.5、料液比 1 g ∶25 mL、提取時間130 min。按此優化條件進行試驗驗證，蛋白提取率達83.5%。

2.5 脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質的電泳分析

從圖8、圖9可見，葡萄籽粕蛋白提取液純化前后主要存在4種蛋白亞基，分子量分別為40、37、19、17ku。純化前蛋白亞基條帶較為復雜，純化后高于40 ku和低于17 ku的蛋白亞基幾乎不存在。從表4可見，純化后4種主要蛋白亞基的總相對含量從63.4%提高到91.5%。經多次重復試驗，樣品蛋白電泳圖譜分析結果具有較好的重現性和穩定性。

3 結論與討論

3.1 討論

常用的葡萄籽蛋白提取方法有鹽析法、堿液浸提法、酶解法等。王俠對鹽析法提取葡萄籽蛋白質條件進行了優化，得出在最佳條件下蛋白提取率為17%[9]；夏輝等采用堿溶酸沉法對葡萄籽中蛋白質進行了提取研究，結果表明最佳條件下蛋白提取率達70.6%[10]；葉潤等利用復合糖酶對蛋白質進行提取，由于采用復合糖酶處理脫脂葡萄籽粉后降低了葡萄籽中半纖維素含量，蛋白提取率有所提高，達 84.6%[11]。本研究所用脫脂脫酚葡萄籽粕在前期提取葡萄籽油和葡萄籽原花青素過程中，由于高壓、高濃度乙醇和高溫使葡萄籽中原有蛋白質結構、性質發生改變，蛋白提取條件較之前文獻報道[7]有所差異。在前期試驗基礎上，選定堿液浸提法為最佳提取方法，通過優化提取條件，使蛋白提取率達83.5%。

由于蛋白質在溶解性、帶電荷性、分子量大小或親和特異性等方面存在差異[12]，常用的分離純化方法有吸附法、超濾法、沉淀法（鹽沉、有機溶劑沉淀、等電點沉淀）、透析法、色譜法（凝膠過濾、離子交換、親和色譜、共價色譜）等。王洪新等對茶葉蛋白的初步純化研究中，采用等電點沉淀-鹽析、丙酮脫色、超濾脫鹽等方法得到了較純茶葉蛋白[13]；徐夢辰等以山藥蛋白酶解液為原料，采用陰離子交換層析和凝膠層析對酶解液中蛋白組分進行了分離純化，取得了較好效果[14]。國內還未見葡萄籽蛋白質純化方面的研究報道。本研究在脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質提取工藝基礎上，針對籽粕蛋白提取液性質設計了一套較為合理的純化工藝，并采用SDS-PAGE電泳對蛋白純化效果進行分析，為后續制備高純葡萄籽分離蛋白、食源蛋白產品開發、多肽制備及活性研究等內容奠定基礎。

3.2 結論

本研究采用堿液浸提法提取脫脂脫酚葡萄籽粕蛋白質，優化確定的最佳提取條件為溫度88 ℃、浸提液pH值 11.5、料液比1 g ∶25 mL、提取130 min，該條件下蛋白提取率達到835%。采用吸附脫色、鹽析-pI沉淀、超濾、納濾等方法對蛋白提取液進行了純化分離，探索純化工藝中各關鍵技術點的工藝條件。最后通過SDS-PAGE電泳分析純化前后的樣品蛋白，發現樣品中含有4種蛋白亞基，分子量分別為40、37、19、17 ku，純化后4種蛋白亞基占總蛋白的相對含量為91.5%。

參考文獻：

[1]許申鴻，杭 瑚，郝曉麗. 葡萄籽化學成分分析及其抗氧化性質的研究[J]. 食品工業科技，2000，21（2）：18-20.

[2]李彥奎，蔣錫龍，魏彥鋒，等. 超臨界CO2萃取葡萄籽油工藝研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2013（5）：31-34.

[3]梁紅敏，高德艷，張晶瑩，等. 葡萄籽多酚功能特性及應用開發現狀[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2014（5）：55-59.

[4]GB/T 21305—2007 谷物及谷物制品水分的測定常規法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[5]GB 5009.5—2010 食品中蛋白質的測定[S]. 北京：中國標準出版社，2010.

[6]王廷華，張云輝，鄒曉莉. 蛋白質理論與技術[M]. 北京：科學出版社，2005：53-54.

[7]李鳳英，崔蕊靜，李春華. 葡萄籽蛋白質的提取工藝研究[J]. 中國油脂，2005，30（4）：50-53.

[8]高德艷，胡文效，魏彥峰，等. 葡萄籽中原花青素的提取與分離[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2013（5）：6-11.

[9]王 俠. 葡萄籽中化學成分的提取分離及結構鑒定[D]. 長春：長春中醫藥大學，2008.

[10]夏 輝，丁丹華，萬 輝. 葡萄籽蛋白提取工藝的研究[J]. 糧油加工，2010（8）：37-39.

[11]葉 潤，馬寶英，牟德華. 從脫脂葡萄籽中提取蛋白質的工藝研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2009（1）：17-21.

[12]陸 健. 蛋白質純化技術及應用[M]. 北京：化學工業出版社，2005：111-112.

[13]王洪新，胡昌云. 茶葉蛋白質提取及初步純化研究[J]. 食品工業科技，2004，25（12）：69-71，73.

[14]徐夢辰，丁 軻，呂 瑩，等. 山藥蛋白酶解液的分離純化[J]. 北京農學院學報，2014，29（3）：94-96.孫春麗，王紫燕，李春陽，等. 市售洋槐蜜多酚類成分及其抗氧化活性研究[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：321-327.