表沒食子酸酯對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激的影響

陳　婷，劉　平，王嘉翔，單　多，車　雯，張麗娟

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·實驗論著·

表沒食子酸酯對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激的影響

陳婷，劉平，王嘉翔，單多，車雯，張麗娟

Citation:Chen T, Liu P, Wang JX,etal. Effect of epigallocatechin-3-gallate against oxidative stress induced by high glucose in human lens epithelium cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(6):1029-1031

摘要

目的：探討表沒食子酸酯(EGCG)對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化應激的影響。

方法：建立高糖誘導的HLEC氧化損傷模型，用不同濃度的EGCG干預，MTT檢測細胞活力，倒置顯微鏡觀察細胞形態，Hoechst-PI染色觀察細胞凋亡，分光光度計檢測上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)的含量。

結果：MTT結果顯示用10μmol/L EGCG和100μmol/L EGCG處理后，HLEC活性分別提高到50.33%±3.52%和63.33%±4.63%，與氧化損傷組(32.67%±3.10%)比較差異具有統計學意義(P<0.05)；EGCG干預的高糖條件下的HLEC較好地保持了細胞的形態，凋亡細胞數量減少，細胞內SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平下降。

結論：EGCG可能通過提高細胞內SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量發揮其較強的抗氧化作用，從而為尋求有效的防治白內障藥物提供可靠的實驗依據。

關鍵詞：EGCG；高糖；晶狀體上皮細胞；氧化應激

引用：陳婷，劉平，王嘉翔，等.表沒食子酸酯對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激的影響.國際眼科雜志2016;16(6):1029-1031

0引言

糖尿病是一組由于胰島素作用障礙和/或胰島素分泌缺陷所致的、以高血糖為特征的代謝性疾病。長期高血糖與持續代謝紊亂可導致全身組織器官，特別是心血管、腎、眼及神經系統的功能障礙。高血糖導致晶狀體纖維腫脹變性，晶狀體上皮細胞凋亡，引起晶狀體透明度改變，最后形成白內障[1]。表沒食子酸酯(EGCG)是從茶葉中提取的主要的兒茶素之一，具有增強抗氧化物酶活性的作用，可有效清除自由基，延緩細胞及組織衰老[2-3]。本文通過體外實驗初步研究了EGCG對人晶狀體上皮細胞(human lens epithelium cells，HLEC)氧化損傷的影響，從而為其用于防治糖尿病性白內障提供實驗依據。

1材料和方法

1.1材料HLEC(美國ATCC公司)，EGCG(美國Sigma公司，純度為>98%)，胎牛血清、DMEM培養基(美國Hyclone公司)，MTT試劑盒(中國上海伯奧生物制品公司)，Hoechst-PI雙染試劑盒(美國BD公司)，過氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)及丙二醛(MDA)活力測定試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1 HLEC的培養HLEC培養在內含鏈霉素100μg/mL、青霉素100U/mL的DMEM培養基中，胎牛血清濃度為10%，培養箱內CO2體積分數為5%，溫度為37℃，細胞接種密度為5×105/mL。

1.2.2細胞分組共分4組：(1)陰性對照組：以正常培養液培養。(2)氧化損傷組：30mmol/L葡萄糖溶液作用12h。(3)EGCG組：加入EGCG作用24h之后，加入30mmol/L葡萄糖溶液作用12h，依EGCG濃度不同分為2個亞組(10μmol/L和100μmol/L)。

1.2.3 MTT檢測細胞活力細胞接種于96孔板(細胞密度5×104/L，每孔120μL)培養24h使細胞同步化，向各孔細胞中加入20μL MTT(5g/L)，培養4h后棄去培養液，加入150μL DMSO溶液，微量振蕩器室溫下振蕩10min后用酶標儀測定492nm的光密度值。HLEC的存活率=(各組細胞光密度值/正常組細胞光密度值)×100%。

1.2.4 Hoechst-PI染色觀察細胞凋亡細胞接種于96孔板中，經相應處理后用PBS洗滌細胞兩次，在150μL的Binding Buffer中加入2μL Hoechst及5μL PI混勻，避光、室溫反應5min后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5氧化應激指標檢測相應干預后取各組細胞，裂解后1200g離心15min取上清液，按試劑盒說明書，使用721D分光光度計測定細胞內SOD、GSH-Px及MDA含量。

2結果

2.1 EGCG對高糖致HLEC氧化損傷后細胞活性的影響氧化損傷組HLEC經氧化損傷處理后，細胞活性明顯下降(32.67%±3.10%)，與陰性對照組(96.07%±3.32%)比較具有顯著統計學差異(t=19.08，P<0.01)。用10μmol/L和100μmol/L EGCG處理后，HLEC活性分別提高到50.33%±3.52%和63.33%±4.63%，兩組之間比較差異無統計學意義(t=2.42，P>0.05)，與氧化損傷組比較差異具有統計學意義(t=5.35、5.98，P<0.05，圖1)。

2.2倒置顯微鏡觀察HLEC的形態學改變正常HLEC貼壁生長，呈長梭形，胞膜完整，細胞間界限清晰；氧化損傷組細胞體積縮小，呈球形改變，出現懸浮細胞(提示壞死細胞的出現)。經EGCG干預的高糖條件下HLEC保持了上皮細胞的形態，較少出現細胞腫脹，EGCG高濃度組細胞形態改善明顯(圖2)。

圖1MTT法檢測EGCG對高糖誘導的HLE細胞活力的影響bP<0.01vs氧化損傷組。

2.3 EGCG對HLEC凋亡的影響陰性對照組細胞核呈均勻致密的暗藍色低熒光，細胞凋亡率為3.00%±0.71%，氧化損傷組細胞凋亡率為35.75%±3.90%，與陰性對照組比較差異具有統計學意義(t=8.26，P<0.05)；圖3可見氧化損傷組細胞出現了亮藍色高熒光，說明部分細胞已經發生凋亡反應，其中紅色點狀高熒光為PI染色陽性，代表壞死細胞。給予不同濃度EGCG干預后，凋亡及壞死細胞數逐漸減少，EGCG低濃度組和EGCG高濃度組細胞凋亡率分別為22.33%±2.32%和6.75%±1.05%，兩組之間比較差異有顯著統計學意義(t=4.03，P<0.01)，與氧化損傷組比較差異具有統計學意義(t=2.47、 7.26，P<0.05，圖3、4)。

2.4 EGCG對HLEC內MDA、SOD和GSH-PX含量變化的影響從表1中可知，氧化損傷組HLEC中SOD及GSH-Px含量與陰性對照組比較明顯下降，MDA含量明顯升高，兩者比較差異具有顯著統計學意義(t=-59.48，P<0.01)，給予EGCG后，隨著作用劑量的升高，MDA含量有下降的趨勢，EGCG低、高濃度組與氧化損傷組比差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；同時EGCG促進了SOD及GSH-Px含量的升高，EGCG高劑量組與氧化損傷組比較差異具有顯著統計學意義(F=1562.63，P<0.01)。

3討論

抗氧化劑EGCG是一種活性氧、自由基的強力清除劑，具有抗突變、抗炎、抗衰老、抗癌、改善肝功能的作用[4-5]。EGCG的保護作用機制包括抑制氧化應激導致的氧化損傷、抑制能量代謝、細胞凋亡和壞死，保護細胞膜[6]。有報道顯示，EGCG的抗氧化活性是SOD的6倍，維生素E的20倍[7]。劉湘萍等[8]通過體外實驗初步證實了EGCG能夠抑制地塞米松誘導的兔晶狀體上皮細胞凋亡，但是對于糖尿病性白內障的保護作用鮮有報道。

晶狀體的能量來自房水中葡萄糖。糖尿病患者晶狀體內葡萄糖增多，經醛糖還原酶的作用活化，葡萄糖轉化為山梨醇。山梨醇不能透過晶狀體囊膜，在晶狀體內大量積聚，使晶狀體內滲透壓增加，吸收水分，上皮細胞及纖維腫脹變性，導致混濁[9]。細胞活力檢測結果也顯示高糖處理的細胞其活力明顯降低，細胞正常形態受到損傷，但是經過EGCG預處理的細胞其活力得到不同程度的改善，細胞形態亦逐漸改善，并且說明該藥物在一定程度上能夠抑制高糖誘導的細胞損傷，而且這種藥物對細胞的保護作用呈劑量依賴性。

糖尿病引起的晶狀體混濁與長時間的積累性氧化損傷導致的細胞凋亡有關，HLEC對氧化應激較為敏感[10]。

圖2各組晶狀體上皮細胞的形態學改變(×400)A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：EGCG低濃度組；D：EGCG高濃度組。

圖3Hoechst-PI染色觀察細胞凋亡(×400)A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：EGCG低濃度組；D：EGCG高濃度組。

表1EGCG對HLEC細胞內MDA、SOD及GSH-PX含量變化的影響

注：bP<0.01vs正常組；dP<0.01vs氧化損傷組。

圖4EGCG對高糖誘導HLEC凋亡的抑制作用aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組；dP<0.01vsEGCG低濃度組。

我們利用30mmol/L葡萄糖建立細胞氧化損傷模型，觀察EGCG對該細胞的保護作用。生理狀態下，機體抗自由基損傷的酶如SOD、GSH-Px能有效地清除活性氧和自由基，使自由基的產生和清除處于平衡，因此清除活性氧和修復氧化損傷被認為是預防和治療白內障行之有效的方法[11]。本實驗中，用EGCG干預后HLEC中SOD、GSH-Px活性較氧化損傷組顯著升高，MDA含量顯著降低，提示EGCG可能通過提高細胞內SOD、GSH-Px含量，降低細胞內MDA含量發揮其較強的抗氧化作用。

綜上所述，EGCG對高糖誘導的HLEC凋亡具有一定的抑制作用，抑制效應與藥物濃度正相關，從而可能減少HLEC凋亡及由此引起的病理損害，為尋求有效的防治糖尿病性白內障藥物提供可靠的實驗依據。

參考文獻

1 Bhadada SV, Goyal RK. Effect of Aqueous Extract of Tephrosia purpurea on Cardiovascular Complications and Cataract Associated with Streptozotocin-induced Diabetes in Rats.IndianJPharmSci2015；77(5): 522-529

2焦西英，楊浩，錢新宏，等. EGCG對過氧化氫所致神經元過氧化損傷的保護作用.解剖學研究 2008；30(6):401-403

3Esmaeili MA. Combination of siRNA-directed gene silencing with epigallocatechin-3-gallate (EGCG) reverses drug resistance in human breast cancer cells.JChemBiol2015；9(1):41-52

4楊志輝，楊華，劉仲華. EGCG清除自由基和抑制血液脂質過氧化作用的研究. 湖南農業科學 2009；4(5): 18-20

5李佳，劉丹. 茶多酚對體外培養鼠晶狀體抗氧化損傷作用的研究. 國際眼科雜志 2012；26(2):169-172

6 Niu Y, Na L, Feng R,etal. The phytochemical, EGCG, extends lifespan by reducing liver and kidney function damage and improving age-associated inflammation and oxidative stress in healthy rats.AgingCell2013；12(6):1041-1049

7楊志輝，楊華，劉仲華. EGCG清除自由基和抑制血液脂質過氧化作用的研究. 湖南農業科學2009；5(5):18-20

8劉湘萍，何湘珍. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制地塞米松體外誘發兔白內障的作用. 國際眼科雜志 2010；10(3):443-446

9 Li Y, Jia Y, Zhou J,etal. Effect of methionine sulfoxide reductase B1 silencing on high-glucose-induced apoptosis of human lens epithelial cells.LifeSci2013；92(3):193-201

10 Mok JW, Chang DJ, Joo CK. Antiapoptotic effects of anthocyanin from the seed coat of black soybean against oxidative damage of human lens epithelial cell induced by H2O2.CurrEyeRes2014；39(11):1090-1098

11周紅艷，郄文斌，溫君琳，等. 不同時間束縛應激對大鼠血清和胃黏膜組織中SOD、MDA的影響. 實用醫學雜志 2014；30(24):3912-3915

Effect of epigallocatechin-3-gallate against oxidative stress induced by high glucose in human lens epithelium cells

Ting Chen, Ping Liu, Jia-Xiang Wang, Duo Shan, Wen Che, Li-Juan Zhang

Foundation item:National Natural Science Foundation of China (No.30973275)

The Third Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

Correspondence to:Li-Juan Zhang. The Third Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University. zhanglijuan715@163.com

Received：2016-03-03Accepted：2016-05-18

Abstract

?AIM: To investigate the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) against oxidative stress induced by high glucose in human lens epithelium (HLE) cells.

?METHODS: The HLE cell oxidative damage model induced by high concentration glucose was established, and was intervented with different concentrations of EGCG. Cell viability was determined by MTT assay, cell morphology was investigated by convert microscope, cells apoptosis was assayed by flow cytometry with Hoechst-PI staining. Moreover, the levels of super oxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and malondialdehyde (MDA) in supernatant were also tested after different treatment either with high concentration glucose or with different concentrations of EGCG.

?RESULTS: MTT results showed that HLE cells activity increased to 50.33%±3.52% and 63.33%±4.63% after treated with 10 μmol/L and 100 μmol/L EGCG respectively, the difference was statistically significant compared with oxidative injury group(32.67%±3.10%)(P<0.05); HLE cells maintained better morphology intervented with EGCG under high glucose conditions, the number of apoptotic cells reduced, SOD and GSH-Px level within HLE cells increased and MDA levels decreased.

?CONCLUSION: EGCG plays its strong antioxidant effect by increasing SOD, GSH-Px content and decreasing MDA content in cells, therefore provides a reliable experimental basis for the search for effective prevention and treatment of cataract drug.

KEYWORDS:?epigallocatechin-3-gallate; high glucose; human lens epithelium cells; oxidative stress

基金項目：國家自然科學基金(No.30973275)
作者單位：(150001)中國黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科三病房

作者簡介：陳婷，護師，研究方向：白內障。

通訊作者：張麗娟，副主任護師，研究方向：白內障.zhanglijuan715@163.com

收稿日期：2016-03-03 修回日期： 2016-05-18

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.6.06