DHA激活NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路誘導ARPE-19細胞表達HO-1①

劉越峰　羅衛民　張　勇　鐘曉東

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院眼科中心，十堰442000)

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DHA激活NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路誘導ARPE-19細胞表達HO-1①

劉越峰羅衛民②張勇鐘曉東

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院眼科中心，十堰442000)

[摘要]目的：觀察二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)誘導人視網膜色素上皮細胞表達血紅素氧合酶(Heme oxygenase，HO)-1的分子機制。方法：培養人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19，加入30～100 μmol/L DHA作用4～24 h。Western blot檢測HO-1的表達及NADPH氧化酶p47phox亞基的磷酸化；熒光探針H2DCFDA檢測活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產生；免疫熒光分析Nrf2在細胞核及胞漿中的表達；最后采用NADPH氧化酶抑制劑DPI，ROS抑制劑NAC或采用siRNA干擾Nrf2表達，檢測其對HO-1表達的影響。結果： 100 μmol/L DHA作用ARPE-19細胞30 min即可誘導p47phox亞基的磷酸化，同時能增加細胞內ROS的含量；采用NADPH氧化酶抑制劑DPI處理后，ROS水平顯著降低；免疫熒光實驗顯示DHA作用細胞2 h后，可誘導Nrf2核轉位，采用DPI或NAC處理后，Nrf2核轉位水平明顯減少；采用Nrf2 siRNA沉默其表達，或采用DPI或NAC處理后，可抑制DHA誘導ARPE-19細胞表達HO-1。結論：DHA可能通過NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路途徑誘導視網膜色素上皮細胞表達HO-1，從而發揮對細胞的保護作用。

[關鍵詞]二十二碳六烯酸；視網膜色素上皮細胞；血紅素氧合酶-1

年齡相關性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)是一種以進行性視網膜黃斑部退行性病變為特征的眼底疾病，好發于45歲人群，并隨年齡增長有關，是常見的不可逆性致盲眼病之一[1,2]。目前認為，AMD是一種與遺傳以及環境因素相關的因素疾病[3]。近年來的觀點認為，氧化應激是多種AMD危險因素致病機制中的重要組成部分。由于黃斑部解剖學與組織學的特殊性，視網膜色素上皮細胞對氧化應激非常敏感：持續暴露于光照之下所積累的光氧化效應，以及視網膜色素上皮細胞吞噬光感受器外節盤膜后，細胞內可產生大量活性氧類(Reactive oxygen species，ROS)。此外，隨著年齡的增長，視網膜色素上皮細胞清除ROS的能力有所降低。在AMD發生的整個階段，由于視網膜色素上皮細胞與光感受器之間存在營養代謝等多方面的相互作用，因而它是AMD病變的中心環節。因此針對視網膜色素上皮細胞氧化應激損傷及保護的研究，對探討其致病機理以及臨床治療具有重要意義。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA) 是一種不飽和脂肪酸，它對中樞神經系統以及視網膜光感受細胞的發育及其功能具有重要的作用。有研究發現，DHA可有效改善光損傷所致的視網膜氧化應激反應，并能上調內源性抗氧化蛋白的表達[4,5]。本研究旨在探討DHA對人視網膜色素上皮細胞表達血紅素氧合酶(Heme oxygenase，HO)-1的影響及分子機制，從而為其臨床應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1主要實驗試劑ARPE-19細胞購自美國ATCC。DMEM培養基、無內毒素胎牛血清購自美國Gibco；DHA、β-actin多克隆抗體、NADPH氧化酶抑制劑DPI、ROS抑制劑NAC以及熒光探針H2DCFDA為Sigma-Aldrich產品。p-p47phox以及鼠抗人total-p47phox購自Cell Signaling?？笻O-1多克隆抗體、Nrf2多克隆抗體和兔抗鼠二抗購自Santa Cruz。Nrf2 siRNA由廣州RiboBio公司合成，siRNA轉染試劑盒購自Qiagen。細胞蛋白提取試劑盒和Bradford蛋白濃度測定試劑為Pierce產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養與處理ARPE-19細胞用DMEM培養基(含10%胎牛血清L-谷氨酰胺和抗生素)，置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養。待細胞生長至密度為80%時，消化、換液并接種至6孔板中，并改用含1%血清的DMEM培養基培養24 h。隨后細胞加入不同濃度的DHA作用4～24 h，提取蛋白用于下一步研究。

1.2.2細胞蛋白提取與Western blotARPE-19細胞經DHA處理結束后，用4℃無菌PBS漂洗1次，加入含蛋白酶抑制劑的Cocktails裂解細胞。胞漿蛋白的提取按照Pierce公司試劑盒(NE-PER Nuclear & Cytoplasmic Extraction Reagents KIT)提供的操作步驟進行。采用Bradford法測定蛋白濃度。并獲取20 μl蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后采用半干轉印方法將其轉印至硝酸纖維素膜上。纖維素膜用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，隨后分別用相應的一抗和二抗孵育，ECL顯影、拍照。

1.2.3ROS測定ARPE-19細胞處理完畢后，加入分子探針染液H2DCFDA(終濃度5 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。經PBS充分洗滌后，在熒光分光光度計(Infinite F200 Pro，TECAN)上設置激發波長485 nm，發射波長530 nm，測量細胞內的熒光強度(Fluorescence intensity)，并計算熒光的相對值，計算公式：處理組熒光強度/對照組熒光強度×100%(Relative intensity)。

1.2.4免疫熒光觀察Nrf2核轉位生長于蓋玻片上的ARPE-19細胞處理完畢后，用3.5%多聚甲醛重懸浮細胞，室溫固定15 min。經甲醇通透10 min并經無菌PBS洗滌后，滴加1%羊血清至蓋玻片上室溫封閉30 min。隨后PBS洗滌3次，并加入抗Nrf2抗體室溫孵育2 h。洗滌后繼續加入C3標記羊抗鼠二抗孵育1 h。激光共聚焦顯微鏡拍照(Nikon C2 Plus)。

1.2.5細胞轉染生長于培養皿中(約5×105)中的ARPE-19細胞更換為無血清培養基培養18～24 h。siRNA的轉染按照Qiagen提供的步驟進行。即100 nmol/L Nrf2 siRNA或對照siRNA與轉染試劑混合后，加至細胞培養液中。4 h后用無菌PBS漂洗細胞，并將無血清培養基更換為完全培養基，隨后加入DHA孵育后用于下一步研究。

2結果

2.1DHA誘導ARPE-19細胞中NADPH氧化酶p47phox亞基磷酸化未經DHA處理的空白對照組細胞中p47phox磷酸化水平極低，當采用100 μmol/L DHA孵育10 min后，可明顯上調細胞內磷酸化p47phox水平，隨著時間的延長，磷酸化水平逐漸增多，1 h后達到峰值，而總p47phox含量保持不變(圖1)。

圖1　DHA誘導ARPE-19細胞p47phox亞基磷酸化Fig.1　DHA induces p47phox subunit phosphorylation in ARPE-19 cells

圖2　DHA與DPI對ARPE-19細胞產生ROS的影響Fig.2　Effect of DHA and DPI on production of ROS in ARPE-19 cellsNote: *.P<0.05,as compared with control (0 μmol/L DHA);#.P<0.05,as compared with 0 μmol/L DHA.

圖3　DPI、NAC對DHA誘導Nrf2核轉位的影響Fig.3　Effect of DPI,NAC and DHA on nuclear translocation of Nrf2

2.2DHA經NADPH氧化酶誘導ROS產生30～100 μmol/L DHA處理ARPE-19細胞4 h后，可有效增加細胞內ROS的含量。而細胞在DHA處理前給予10 μmol/L DPI預處理1 h，結果顯示ROS含量明顯降低(圖2)。

2.3DHA經ROS激活Nrf2ARPE-19細胞在DHA處理前，Nrf2位于細胞漿中。經100 μmol/L DHA處理4 h后，細胞核中Nrf2顯著增多。而ARPE-19首先用10 μmol/L DPI或10 mmol/L NAC預處理1 h后，可顯著抑制DHA誘導Nrf2核轉位(圖3)。

2.4DHA上調ARPE-19細胞中HO-1蛋白表達未刺激時，ARPE-19細胞內HO-1蛋白表達水平很低。采用30、50和100 μmol/L DHA刺激18 h后，HO-1蛋白表達水平隨著DHA濃度的增高而遞增(圖4)。

圖4　DHA上調ARPE-19細胞表達HO-1蛋白Fig.4　DHA induces HO-1 expression in ARPE-19 cells

圖5　DPI、NAC或Nrf2 siRNA對DHA誘導HO-1表達的影響Fig.5　Effect of DPI,NAC and Nrf2 siRNA on DHA-induced HO-1 expressionNote: A.DPI and NAC on DHA induced HO-1 expression;B.Effect of Nrf2 siRNA on DHA-induced HO-1 expression.

2.5DHA誘導HO-1產生與NADPH氧化酶/ROS/Nrf2有關ARPE-19細胞在DHA處理前，HO-1表達量極低。經100 μmol/L DHA處理18 h后，細胞中HO-1表達顯著增多。而ARPE-19首先用10 μmol/L DPI或10 mmol/L NAC預處理1 h后，可顯著抑制DHA誘導HO-1表達。此外，采用siRNA干擾Nrf2表達后，HO-1表達水平也顯著減少(圖5)。

3討論

AMD是與衰老密切相關的一種疾病，長期以來，氧自由基學說占有十分重要的地位。各種活性氧的產生所致的氧化應激反應，在多種年齡相關性疾病如白內障、Parkinson病、Alzheimer病中與AMD具有類似的病理生理特征。有研究表明，給予抗氧化制劑后，可有效改善視網膜色素上皮細胞功能，而這一過程與上調HO-1的表達有關。HO是降解血紅素代謝為CO、Fe2+和膽綠素的限速酶。生理條件下，HO共有三種同工酶，即HO-1、HO-2和HO-3，其中僅HO-1為誘導型。多種病理生理狀態，如氧化應激、感染、糖尿病和視網膜病變等因素均可上調其表達[6]。HO-1可通過其產物CO、膽紅素和Fe2+而發揮細胞保護作用，包括降低TNF-α的促凋亡毒性[7]，維持血管內皮細胞的生理功能，減輕炎癥和氧化應激損傷[8]。

研究表明，HO-1的表達受多種激酶和核轉錄因子的調控。NADPH氧化酶也稱NOX，是由質膜結合成分和胞漿成分組成的一個多酶復合體，其中胞漿部分主要由p47phox、p67phox、p40phox、Rac2、Cdc42等組成。多種外源性因素可誘導p47phox磷酸化，后者隨后由胞漿轉位到質膜，從而組裝成有具有完整功能的NADPH氧化酶。因此可通過檢測p47phox的磷酸化水平間接判斷NADPH氧化酶的激活[9]。隨后NADPH 氧化酶可通過一系列電子傳遞催化ROS的生成，包括O2·、H2O2、HO·、NO·等。盡管ROS的過度產生可引起細胞大分子如蛋白質、DNA的氧化損傷，但適量的ROS也是細胞內的重要信號分子[10]。有研究顯示，多種因素所致的HO-1表達與ROS有關[11]。本研究也發現，DHA處理后，可明顯誘導ARPE-19細胞產生ROS。而采用NADPH氧化酶抑制劑DPI處理后，ROS產生顯著降低。而同時采用ROS清除劑NAC處理后，HO-1表達顯著減少，這表明HO-1的表達受NADPH氧化酶/ROS的調控。

Nrf2是一種重要的氧化應激轉錄保護因子。生理條件下Nrf2存在于胞漿中，并與胞漿中抑制蛋白Keap1相結合。當細胞受到各種外源性刺激時，Keap1經泛素化降解而促使其與Nrf2分離。Nrf2隨后轉移至細胞核內與基因 5′非編碼區的抗氧化應激反應性元件(Antioxidant response element，ARE)相結合而啟動相關基因的轉錄[12]。本研究也發現DHA處理后，Nrf2轉移至細胞核內而調控HO-1的表達。此外，通過采用DPI或NAC處理后，Nrf2的核轉位受到明顯抑制，這表明Nrf2的激活與NADPH氧化酶/ROS有關。同時，采用Nrf2 siRNA沉默后發現，HO-1的表達顯著減少，這表明HO-1的表達最終受ROS/Nrf2的調控。

總之，本研究證實DHA通過激活NADPH氧化酶/ROS信號通路，從而誘導HO-1的表達，HO-1可能通過多種機制發揮對氧化應激的細胞保護作用。但由于參與調控HO-1表達的激酶眾多，如PI3K/Akt，蛋白激酶C等，這一切還有待進一步深入研究。

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[收稿2015-09-20修回2015-11-17]

(編輯倪鵬)

Docosahexaenoic acid induces retinal pigment epithelial cells expression of heme oxygenase-1 by activation of NADPH oxidase/ROS/Nrf2

LIUYue-Feng,LUOWei-Min,ZHANGYong,ZHONGXiao-Dong.

DepartmentofOphthalmology,TaiheHospitalofShiyanAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China

[Abstract]Objective:To observe the molecular mechanism of Docosahexaenoic acid (DHA) on the expression of heme oxygenase (HO-1) in human retinal pigment epithelium cells.Methods: Human retinal pigment epithelium cell line ARPE-19 was cultured in vitro and was treated with 30-100 μmol/L DHA for 4-24 h.Phosphorylation of NADPH oxidase p47phoxsubunit was detected by Western blot.Production of reactive oxygen species (ROS) was detected by fluorescent probe.Activation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was detected by immunofluorescence.At last,DPI,an inhibitor of NADPH oxidase,NAC (ROS inhibitor),or Nrf2 siRNA was used to test their effect on HO-1 expression.Results: Treatment of ARPE-19 cells by 100 μmol/L DHA for 30 min could phosphorylate the p47phoxand increase the production of ROS.Preincubation of the NADPH oxidase inhibitor DPI significantly decrease the ROS level.Nuclear translocation of Nrf2 was also induced after DHA stimulation for 2 h,as demonstrated by immunofluorescence,DPI and NAC could inhibit the nuclear translocation of Nrf2.Transfection of Nrf2,or incubation of DPI and NAC could significantly abrogate DHA induced HO-1 expression.Conclusion: DHA protects retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via NADPH oxidase/ROS/Nrf2 pathway.

[Key words]Docosahexaenoic acid;Retinal pigment epithelial cells;Heme oxygenase-1

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.009

作者簡介：劉越峰(1978年-)，女，碩士，主治醫師，主要從事眼底疾病的基礎與臨床研究，E-mail：liuyuefeng828@126.com。通訊作者及指導教師：羅衛民(1978年-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事轉化醫學的基礎與臨床研究，E-mail：weiminluo120@163.com。

中圖分類號R774.5

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0644-04

①本文受十堰市科學技術研究與開發項目計劃(14Y40)資助。

②湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院心胸外科，十堰442000。