模式識別受體TLR3、RIG-I和MDA5在慢性乙肝患者外周血的表達水平①

牟　娜　樊秀紅　郭連峰　李　寧　曾瑞紅

(河北衡水哈勵遜國際和平醫院，衡水053000)

?

模式識別受體TLR3、RIG-I和MDA5在慢性乙肝患者外周血的表達水平①

牟娜樊秀紅②郭連峰李寧曾瑞紅③

(河北衡水哈勵遜國際和平醫院，衡水053000)

[摘要]目的：觀察慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中單個核細胞胞膜和胞質模式識別受體mRNA的表達表達水平。方法：54例慢性乙型肝炎患者為實驗組， 40例健康體檢者為對照組。采集實驗組和對照組的新鮮空腹抗凝血，分離單個核細胞，提取單個核細胞中RNA，并反轉錄為cDNA，應用實時定量PCR技術檢測Toll樣受體3(TLR3)、維甲酸誘導基因-I(RIG-I)、黑色素瘤分化相關分子5(MDA5)、I型干擾素(IFN-α、IFN-β)、轉錄因子3(IRF-3)mRNA表達水平。結果：與正常對照組比較，實驗組的TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA表達水平均明顯降低，具有顯著性差異(P<0.05)。高病毒載量組中的各分子表達水平與低病毒載量組和健康對照組比較降低更明顯，且TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平分別與HBV-DNA的含量呈負相關(r=-0.697、-0.738、-0.867、-0.618、-0.415、-0.573)。結論：細胞胞膜(TLR3)和胞質(RIG-1、MDA5)模式識別受體、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平在慢性乙型肝炎患者的外周血單個核細胞中的表達降低，可能與HBV感染的慢性化狀態有關。

[關鍵詞]慢性乙型肝炎；TLR3；RIG-1；MDA5；IFN-α；IFN-β；IRF-3

目前全世界約有3.5億慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染者，約占全球人口的6%，我國作為乙肝的多發流行區，約占全球HBV表面抗原總攜帶率的50%，且60%的人受過HBV的感染[1]。慢性乙型肝炎是由HBV感染而致病的炎癥性疾病，感染持續半年以上，表現為持續性感染。乙型肝炎的治療最終取決于宿主免疫系統與病毒毒力之間的力量對比。天然免疫是機體抵抗病毒感染的重要防線，在抵抗乙型肝炎病毒感染時同樣發揮著重要的作用[2]。

天然免疫系統要依賴識別受體模式識別入侵的外源病原微生物，然后將其清除掉。哺乳動物主要具有兩類微生物識別系統,一類是膜結合受體,如Toll樣受體(Toll like receptors,TLR)[3],存在于細胞膜和細胞器室膜上，識別胞外微生物,然后活化細胞內信號激發機體的免疫反應;另一類是細胞質中的模式識別受體,包括具有螺旋酶結構域的抗病毒蛋白視黃酸(維甲酸)誘導基因蛋白I (Retinoic acid inducible gene,RIG-1)和黑色素瘤分化相關抗原5 (Melanoma differentiation-associated gene5,MDA5)，在病毒感染過程中，這些分子均可識別病毒的RNA，在機體抗病毒的免疫應答中發揮著十分重要的作用。本研究旨在考察兩類模式識別受體(TLR3、RIG-1、MDA5)和I型干擾素在慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞的表達情況。為探索慢性乙肝的致病機制提供新的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料收集2012年11月至2014年1月之間來河北省衡水市哈勵遜國際和平醫院就診的慢性乙型肝炎患者54例為實驗組，其中男32例，女22例。年齡18～64歲;平均年齡(38.8±10.7)歲。診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準[4]。另同期收集40例排除慢性乙型肝炎等多種疾病的健康人為實驗對照組，其中男性26例，女性14例；年齡21～59歲，平均年齡(36.7±9.8)歲。兩組在性別、年齡的差異無統計學意義。本研究得到我院倫理委員會批準并取得所有受試者的知情同意。

1.1.2實驗儀器和試劑

1.1.2.1主要試劑淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)。Total RNA提取試劑[寶生物工程(大連)有限公司]；PCR反應體系(康為世紀公司)；PCR引物[英濰捷基(上海)有限責任公司]；DEPC水(美國Promega公司)。ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司)。

1.1.2.2主要儀器熒光定量PCR儀[上海宏石醫療科技有限公司(SLAN)]；生物安全柜[濟南市鑫貝西生物技術有限公司(BSC-1100ⅡB3)]；酶標儀[芬蘭Labsystem Dragon公司(Wellscan MK2)]；恒溫水浴箱[北京市永光明醫療儀器廠(DHP-600)]；干式恒溫器[江蘇省海門其林貝爾儀器制造公司(GL-150B)]；低溫超速離心機[珠海黑馬醫療器械公司(TGL-16R)]。

1.2實驗方法

1.2.1標本采集在實驗組與對照組人員空腹的狀態下各采集全血8 ml，其中2 ml加入到干管中使血清自然析出，用來檢測生化指標和干擾素的蛋白質含量；剩余的6 ml則平均加到兩個肝素抗凝管中，每管3 ml，馬上對其進行單個核細胞的分離。把分離好的單個核細胞和收集好的血清分別進行編號、記錄后，保存于-80℃的低溫冰箱中備用。

1.2.2提取RNA按照Trizol說明書提取實驗組和對照組的單個核細胞，加入Trizol試劑使細胞充分溶解，得到勻漿裂解液放-80℃低溫冰柜保存，以備集中提取RNA。在裂解液中加入1/5體積量的氯仿，劇烈震蕩充分乳化。12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上清液，加入1 ml的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，室溫靜置10 min。12 000 r/min，4℃離心10 min。得到總RNA。75%的DEPC酒精1 ml洗滌RNA，在用DEPC水溶解RNA。

1.2.3反轉錄將1 μl的 Oligo(dT)18 primer，3 μl 的已提取的RNA，8 μl 的Water,nuclease-free，總共為12 μl，混勻，置于65℃干熱恒溫器上，5 min。然后加入4 μl 的5×Buffer，1 μl的RiboLock Rnase inhibitor(20 U/μl),2 μl的Mm dNTP Mix和1 μl的RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μl)，點動離心，置于42℃水浴箱，1 h；最后放在干熱恒溫器上，將其調至70℃，5 min。

1.2.4PCR反應體系和流程體系：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)25 μl+ Forward Primer (10 μmol/L) 1.0 μl+ Reverse Primer (10 μmol/L)1.0 μl + cDNA 1.0 μl + RNase-Free Water 22 μl；流程： 預變性：95℃,10 min→變性:95℃,15 s→退火/延伸：60℃,1 min。共40個循環。擴增后通過凝膠成像，經全自動凝膠成像分析儀掃描DNA條帶灰度值，軟件分析條帶灰度比值。

1.2.5計算方法計算方法:mRNA 的相對表達量以2-△△CT表示[5]①實驗組測定CT值減去其內參的CT值，得到△CT1。②正常對照組CT值減去其對應內參CT值，得到△CT2，從△CT2找出一個適中的數值做標準△CT。③實驗組△CT1減去標準△CT，得到△△CT1，計算出2-△△CT1。④正常對照組△CT2減去標準△CT，得到△△CT2，計算出2-△△CT2。進行統計分析。

1.2.6血清HBV DNA檢測所有標本均在室內質量控制合格的條件下進行檢測。采用PCR結合熒光探針的體外DNA擴增和檢測技術定量檢測DNA含量。根據患者HBV拷貝數分為高病毒載量(>105copies/ml)和低病毒載量(<105copies/ml)。血清IFN-α和IFN-β蛋白檢測：采用ELISA試劑盒，嚴格按照說明書進行操作，測出的標準曲線,其相關系數均在0.99以上。

2結果

2.1外周血單個核細胞中TLR3、RIG-1、MDA5 、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA的表達情況實驗組的TLR3、RIG-1、MDA5 、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平與健康對照組比較均降低。高病毒載量組與低病毒載量組比較，高病毒載量組均比低病毒載量組降低。見表1。

2.2各組PBMC中TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA的表達高病毒載量組和低病毒載量組的TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA 表達水平顯著低于健康對照組，且高病毒載量組進一步低于低病毒載量組。見圖1。

2.3病毒載量和mRNA的相關性分析實驗組的TLR3、RIG-1、MDA5、 IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA水平，分別與HBV-DNA的含量(log copies/ml)呈負相關(r=-0.697、-0.738、-0.867、-0.618、-0.415、-0.573)具有顯著性差異，P<0.05。見圖2。

圖1　RT-PCR檢測TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA的表達Fig.1　TLR3，RIG-1，MDA5 mRNA expression detected by RT-PCRNote: 1.NC group；2 .Low virus load group；3.High virus load group.

GroupTLR3RIG-1MDA5IRF-3IFN-αIFN-βNCgroup(n=40)22.76±10.7829.01±8.9125.4±11.9833.16±14.1443.16±18.3439.16±18.17Lowvirusload(n=30)11.31±3.291)18.26±7.201)13.75±5.091)18.35±4.651)23.79±18.921)20.25±18.631)Highvirusload(n=24)6.34±3.052)9.40±4.992)6.68±3.242)12.37±6.552)18.35±8.632)12.88±6.052)

Note：1)P<0.05 compared with NC group;2)P<0.05 compared with Low virus load.

圖2　病毒載量和TLR3、RIG-1、MDA5、 IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA的相關性分析Fig.2　Correlation analysis among HBV-DNA and TLR3，RIG-1，MDA5， IFN-α，IFN-β，IRF-3 mRNA in all patients with CHB

圖3　用酶聯免疫法檢測的的血清中IFN-α、IFN-β的蛋白質水平Fig.3　Protein level of IFN-α and IFN-β in serum by ELISANote: P<0.05.

2.4干擾素的蛋白水平

2.4.1IFN-α的蛋白含量IFN-α的蛋白含量在慢性乙型肝炎患者中的表達降低，實驗組蛋白質的平均測定濃度為22.76 pg/ml，SD為4.71。而正常對照組的平均測定濃度為145 pg/ml，SD為20.01。實驗組平均值比正常對照組平均值低6.37倍，表達水平明顯降低。兩組數據使用統計軟件進行統計，t=3.264,P<0.05，具有統計學意義。見圖3。

2.4.2IFN-β的蛋白含量IFN-β的實驗組蛋白平均測定濃度為3.96 pg/ml，SD為1.57，正常實驗對照組平均濃度為31.34 pg/ml，SD為3.62，IFN-β蛋白質水平在慢性乙肝患者體內表達明顯降低。兩組數據應用SPSS13.0統計軟件進行統計，t=4.023,P<0.05，具有統計學意義。見圖3。

3討論

乙型肝炎病毒(HBV)是一種隱形病毒，侵染肝細胞后，能夠干擾肝細胞正常的新陳代謝，如HBV破壞肝細胞的線粒體，HBV在肝細胞內增殖活躍進而造成肝細胞破損，呈現慢性炎癥急性發作或慢性炎癥持續存在的表現[6]。

到目前為止，人類已發現的Toll樣受體(TLR)有13種[7]，分別命名為TLR1-TLR13，TLR可通過識別病原相關的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，引發信號轉導，導致炎癥介質的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要橋梁。其中只有TLR 3與病毒感染有關，是通過IRF3信號通路分泌干擾素的[8]。

RIG-I和MDA5屬于同源 RNA 螺旋酶，均可識別病毒來源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)，并且具有識別不同病毒入侵的功能[9]。MDA5和 RIG-I是兩個細胞漿內極其重要的抗病毒分子,可識別病毒相關的分子模式，從而介導機體抗病毒天然免疫應答[10]。當病毒感染時，細胞內大量產生dsRNA ,MDA5和 RIG-I均可以通過識別dsRNA 進而激活 NF-κB 和干擾素調節因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF3)[11],從而誘導具有抗病毒作用Ⅰ型干擾素的生成。IRF-3存在于細胞質溶膠中，是調節Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)產生的最重要的轉錄因子，且它能有效激活IFN-α和IFN-β基因[12]，干擾素具有廣譜抗病毒和免疫調節兩方面的作用，可抑制病毒DNA復制和RNA合成，促進病毒RNA降解，抑制病毒蛋白的合成和轉運及病毒顆粒的成熟和分泌等[13]。因此RIG-I和MDA5也能激活Ⅰ型干擾素的合成。與Toll樣受體不同，RIG樣螺旋體是胞質可溶性蛋白，可以直接或間接識別進入細胞內的病原體及其產物，RIG-I信號通路的活化能夠促進干擾素的產生，而干擾素又能夠進一步的促進RIG-I的表達，從而形成一個正反饋過程[14]。考慮到病毒生活史的大部分時間均發生于細胞漿內[15]，因此胞質模式識別受體在啟動病毒感染誘發的Ⅰ型干擾素誘生中可能發揮重要作用。

本研究結果發現，慢性乙肝患者外周血單個核細胞中模式識別受體(TLR3、MDA5、RIG-I)、IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA 水平均降低，且均明顯低于健康對照組(P<0.05)。高病毒載量組又低于低病毒載量，具有統計學意義(P<0.05)。高病毒載量患者體內的數值明顯低于低病毒載量患者，可能是因為HBV抑制了模式識別受體的作用，導致HBV逃逸機體的天然免疫，這可能是HBV感染慢性化的發病機制之一。與趙鋼德等[16]研究結果一致。TLR3 mRNA低表達可能是由于乙肝病毒侵入機體后，其DNA整合到宿主肝細胞內，不表達或是低表達PAMPs，抑制機體的TLR3的表達，使其不能發揮作用，不能清除或是不能完全清除乙肝病毒。與周蘭英等[17]的報道基本一致。實驗組的TLR3、RIG-1、MDA5、IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA水平，分別與HBV-DNA的含量呈負相關具有顯著性差異，P<0.05。

我們考察了干擾素在血清中的蛋白表達的水平情況，實驗組和正常對照組中的水平與其mRNA 水平一致，表明mRNA的表達水平具有代表性；結果提示模式識別受體可能在乙肝炎癥發展中發揮著重要作用，調節模式識別受體的水平可能成為乙型肝炎治療的一條新途徑。

目前病毒性肝炎抗病毒治療的主要措施就是使用干擾素，胞膜和胞質模式識別受體在抗HBV感染的固有免疫應答中發揮著重要作用，因此，針對PRRs信號通路中某些環節進行干預，調節PRRs表達水平控制HBV感染，可能成為新的抗病毒策略。同時，一些新信號的轉導機制的發現可能為我們提供治療靶點。

參考文獻：

[1]病毒性肝炎防治方案(試行).2010年西安全國傳染病寄生蟲病學術會議修訂[J].中華傳染病雜志,2010,8(6):324.

[2]Abe M,Onji M.Mechanisma of the immune response against HBV infection [J].Nihon Rinsho,2011,69(Suppl4):369-373.

[3]Barbalat R,Ewald SE,Mouchess ML,etal.Nucleic Acid recognition by the innate immune system[J].Annu Rev Immunol,2011,29:185-214..

[4]中華醫學會肝病學分會,中華醫學會感染病分學會.慢性乙型肝炎防治指南(2010版)[J].中華肝臟病雜志,2011,19(1):13-24.

[5]高西陽，李攙，潘修成,等.慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞Tim-3 表達的檢測及意義[J].細胞與分子免疫學雜志，2013,29(7):739-743.

[6]Zhao G,An B,Zhou H,etal. Impairment of the retinoic acid-inducible gene-I-IFN-β signaling pathway in chronic hepatitis B virus infection[J].Int J Mol Med,2012,30(6):1498-1504.

[7]丁德平，韓瑛，陳悅.干擾素誘生及其抗病毒信號通路研究進展[J].中西醫結合肝病雜志，2013，23(30):121-123.

[8]Jiang M,Broering R,Trippler M,etal.Toll-like receptor-mediated immune responses are attenuated in the presence of high levels of hepatitis B virus surface antigen[J].J Viral Hepat，2014,21(12):860-872.

[9]Reikine S,Nguyen JB,Modis Y.Pattern recognition and signaling mechani-sms of RIG-I and MDA5[J].Front Immunol，2014,5:342.

[10]Loo YM，Gale M Jr.Immune signaling by RIG-I like receptors[J].Immunity,2011,34(5)：680-692．

[11]Grandvaux N,Guan X,Yoboua F,etal.Sustained activation of interferonregulatory factor 3 during infection by paramyxoviruses requires MDA5[J].J Innate Immun,2014,6 (5):650-662.

[12]Pantel A ,Teixeira A ,Haddad E,etal.Direct type I IFN but not MDA5/TLR3 activation of dendritic cells is required for maturation and metabolic shift to glycolysis after poly IC stimulation [J].PLoS Biol,2014,12 (1):e1001759.

[13]侯周華,譚德明,彭敏源,等.慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前后外周血樹突狀細胞的變化[J].中國現代醫學雜志,2014,24(4):38-41.

[14]Lu HL,Liao F.Melanoma differentiation-associated gene 5 senses hepatitis B virus and activates innate immune signaling to suppress virus replication [J].J Immunol,2013,191(6):3264-3276.

[15]Feng Q,Langereis MA,Olagnier D,etal.Coxsackievirus cloverleaf RNA containing a 5′ triphosphate triggers an antiviral response via RIG-I activation[J].PLoS One，2014,9(4):e95927.

[16]趙鋼德,石翠翠,王暉,等.維甲酸誘導基因-Ⅰ誘導干擾素的產生在乙型肝炎病毒感染清除中的作用[J].肝臟,2012,17(8):554-557.

[17]周蘭英,蔣樂龍,李定梅,等.慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞Toll樣受體3的表達降低[J].基礎醫學與臨床,2013,33(8):1028-1031.

[收稿2015-07-04修回2015-07-20]

(編輯許四平)

Expression level of pattern recognition receptors TLR3,RIG-I and MDA5 in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B

MUNa，FANXiu-Hong,GUOLian-Feng,LINing,ZENGRui-Hong.

ClinicalLabratoryDepartment,HarrisonIntornationalPeaceHospital,Hengshui053000,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of the PRRs in the cytomembrane and cytoplasm in the peripheral blood of patients with CHB.Methods: 54 patients with the CHB were the experimental group，while 40 healthy persons served as the control group.Anti-coagulant fresh blood on an empty stomach was drawed from both experimental groups and control group.The mononuclear cells were separated.RNA of mononuclear cells was extracted and reverse transcribed into cDNA.The relative mRNA expression of TLR3,RIG-I,MDA5,IFN-α,IFN-β and IRF-3 was detected with real-time quantitative PCR.Results: The relative mRNA expression of TLR3,RIG-1,MDA5,IFN-α,IFN-β and IRF-3 of the two experimental groups were significantly lower than that in control group (P<0.05).The relative mRNA levels of these moleculars in the experimental group with high virus load was lower significantly than those in the experimental group with low virus load .The levels of TLR3，RIG-I，MDA5，IFN-α，IFN-β，IRF-3 expression have negative correlation to loads of HBV(r=-0.697，-0.738，-0.867，-0.618，-0.415，-0.573).Conclusion: The mRNA expression levels of the PRRs (TLR3,RIG-1 and MDA5) in the peripheral blood mononuclear cells of the patients with CHB were significantly decreased.May be associated with chronic HBV infection status.

[Key words]Chronic hepatitis B;TLR3;RIG-1；MDA5;IFN-α；IFN-β；IRF-3

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.025

作者簡介：牟娜(1982年-)，女，碩士，主要從事HBV感染和免疫方面研究。通訊作者及指導教師：曾瑞紅(1970年-)，女，碩士生導師，教授，主要從事基礎免疫學研究，E-mail:zengruihong1970@sina.com。

中圖分類號R392.12

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0715-05

①本文為河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究資助項目(12966117D)。

②衡水市景縣人民醫院，衡水053000。

③河北醫科大學免疫教研組，石家莊050000。