大鼠正畸牙移動過程中牙周膜骨硬化蛋白的表達

陳一文　高尚　許彤彤　張佳慧　李金城　李金成張慧彥　盧金金　胡敏　劉志輝.吉林大學口腔醫院正畸科；.修復科，長春 300

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大鼠正畸牙移動過程中牙周膜骨硬化蛋白的表達

陳一文1高尚1許彤彤1張佳慧1李金城1李金成1張慧彥1盧金金1胡敏1劉志輝2
1.吉林大學口腔醫院正畸科；2.修復科，長春 130012

[摘要]目的觀察正畸牙移動過程中大鼠牙周組織中骨硬化蛋白（Sclerostin）的表達及分布，研究Sclerostin在正畸牙移動骨改建中的作用。方法選取24只Wistar大鼠，安裝加力裝置，加載50 g力近中移動左側第一磨牙，分別于安裝加力裝置后的0、1、3、5、7、14 d處死大鼠，用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察第一磨牙牙周組織形態學變化，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色觀察破骨細胞的數量變化，免疫組織化學染色方法探究第一磨牙牙周膜中Sclerostin的表達變化。結果HE染色顯示隨加力時間的延長壓力側骨組織破壞逐漸加重，免疫組織化學染色顯示Sclerostin的表達逐漸增加，5 d時達到高峰，之后又逐漸降低，壓力側表達多于張力側。結論Sclerostin可能通過Wnt信號通路或者直接或間接控制骨形態發生蛋白參與了正畸牙移動骨改建過程。

[關鍵詞]骨硬化蛋白；牙周膜；正畸牙移動

Supported by: The National Natural Science Foundation of China(81470764);Vital Science and Technology Project Supported by Jilin Provincial Science and Technology Department(20140204066SF);Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship(2013B78356).Correspondence: Hu Min, E-mail: humin@jlu.edu.cn.

正畸牙移動是機械力作用下牙周組織發生改建來完成的，其中牙周膜的生物力學作用起著至關重要的調控作用。牙周膜中包含具有分化潛能的成纖維細胞群體，它們對機械刺激高度敏感。機械刺激可以作為一種信號轉換成生物反應和不同細胞的行為變化，比如細胞增殖和蛋白質表達，最終導致牙周組織的改造和適應性變化。已有研究證實，體外培養的牙周膜細胞具有向成骨樣細胞分化的能力，表達成骨基因標識及形成鈣結節[1]，也可表達骨硬化蛋白（Sclerostin）[2]。Sclerostin是近些年來發現的一種對成骨細胞具有抑制作用的糖蛋白，激素水平、機械刺激以及低氧等外部條件的改變能影響Sclerostin的表達。本實驗通過蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、免疫組織化學染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色，觀察加力不同時間段Sclerostin在牙周膜內的分布和表達趨勢，探討Sclerostin在正畸牙移動頜骨改建中的作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物

選取由吉林大學實驗動物中心提供的8周齡雄性Wistar大鼠24只，實驗動物體重為180～220 g，本實驗中所有的實驗流程都遵循吉林大學動物實驗的指導方針。

1.2大鼠正畸牙移動頜骨改建模型的建立

以Wistar大鼠的上頜切牙作為支抗，使用鎳鈦拉簧提供持續牽引力（50 g）近中移動左側第一磨牙，右側第一磨牙作為對照側，不安裝加力裝置。每8 h分別檢查加力裝置脫落情況，如有損壞和脫落立即重新結扎。

1.3標本制備

所有動物分別于加力后的0、1、3、5、7、14 d心臟灌注法處死：腹腔注射4%水合氯醛（0.01 mL·g-1）麻醉，剪開右心耳，從左心室心尖向心臟內緩慢推入生理鹽水，待流出的液體清亮后用同樣的方法推入4%多聚甲醛溶液，至大鼠肌肉僵硬。取大鼠左側上頜磨牙及周圍組織，將標本固定于4%多聚甲醛溶液中。24 h后取出，常溫下浸泡10%中性乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液中脫鈣2個月，依次進行脫水、透明、浸漬、包埋，按平行于第一磨牙近遠中向連續切片，切片厚度為3 μm。選取第一磨牙牙根及牙周組織完整的切片經過脫蠟透明后進行HE染色、TRAP染色和免疫組織化學染色。

1.4染色

1.4.1HE染色將制好的切片按照常規步驟進行HE染色。

1.4.2免疫組織化學染色染色前，組織切片需用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。然后用過氧化氫酶阻斷劑在室溫下孵育10 min以抑制過氧化氫酶活性。接著用PBS緩沖液沖洗，滴加血清以減少背景染色。之后去除血清后滴加1︰100比例稀釋后的第一抗體，在4 ℃下濕盒中過夜孵育。然后用PBS沖洗，加入第二抗體，室溫下孵育10 min。最后滴加DAB顯色液使免疫反應可見。

1.4.3TRAP染色按照試劑盒上的說明嚴格進行操作。

1.5圖像分析

在每張切片張力側與壓力側牙周組織分別隨機選取3個不重疊視野進行圖像采集，采用Image Pro Plus圖像分析軟件測量圖像的平均光密度（optical density，OD）和破骨細胞計數。破骨細胞計數選取200×視野，針對陽性染色且位于Howship陷窩同時細胞核數量不小于3者予以計數；光密度選取牙周膜區域的400×視野進行測量。二者均由同一有經驗的實驗者重復3次后取平均值。

1.6統計方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對多組樣本進行多組樣本均數的LSD檢驗。

2　結果

2.1大鼠牙周組織形態學變化

實驗組未加力時牙周組織形態完整良好，牙槽骨邊緣平整。加力1 d時，壓力側牙周膜厚度逐漸減小，張力側逐漸增寬；至加力3 d時，壓力側牙槽骨邊緣開始出現較為明顯的骨吸收陷窩，其內可見破骨細胞。隨著加力時間的延長，壓力側骨吸收范圍逐漸擴大，骨組織的破壞明顯，至加力14 d時仍未見吸收陷窩修復的表現，剩余牙槽骨面積縮?。▓D1）。

2.2免疫組織化學染色結果

實驗組未加力時拉力側與壓力側均未發現有Sclerostin陽性表達。隨著加力時間的延長，Sclerostin表達逐漸增加（圖2），在5 d時Sclerostin表達達到高峰，隨之表達逐漸降低，5 d和7 d時壓力側Sclerostin表達多于張力側，且差異具有統計學意義（P<0.01）（圖3）。

2.3TRAP染色結果

破骨細胞數量隨時間的變化趨勢與免疫組織化學結果相似，實驗組未加力時少見破骨細胞，隨加力時間的增加，壓力側牙槽骨邊緣可見多核、胞漿紅染的破骨細胞（圖4），5 d時數量達到高峰，隨之逐漸降低，3、5和7 d組破骨細胞數量壓力側多于張力側（P<0.01）（圖5）。

圖2　加力不同時間牙周膜中Sclerostin的觀察結果　免疫組織化學染色　× 400Fig 2　Results of Sclerostin expression in periodontal ligament after applied orthodontic force for different days　immunohistochemical staining　× 400

圖3　加力不同時間牙周膜中Sclerostin免疫組織化學染色平均OD值Fig 3　The mean OD of Sclerostin immunohistochemical staining　in periodontal ligament after applied orthodontic force for　different days

圖4　加力5 d時骨吸收陷窩內可見陽性表達的破骨細胞　　TRAP 染色Fig 4　TARP-positive osteoclasts in Howship’s lacuna after applied　orthodontic force for 5 days　TRAP staining

圖5　不同加力時間TRAP染色陽性細胞計數Fig 5　Count of the TRAP-positive cells after applied orthodontic　force for different days

3　討論

3.1Sclerostin在正畸牙移動頜骨改建中的作用

Sclerostin是由骨細胞等骨源性細胞分泌的一種，可以通過Wnt通道抑制骨形成的糖蛋白[3]，在破骨細胞生成、成骨細胞分化中起到較為重要的作用。

牙周膜細胞中包含具有多分化潛能的細胞群體，能分化為成骨細胞、成牙骨質細胞等，能維持牙周組織代謝和平衡，并參與其改建的作用，是正畸過程中骨改建的關鍵[4]。國內學者[2]在人牙周膜細胞礦化誘導過程中證實Sclerostin參與人牙周膜細胞向成骨樣細胞的分化過程。本研究通過建立大鼠正畸牙移動模型，擬探究正畸力作用下Sclerostin的表達機制。

3.2實驗結果分析

本研究實驗組牙周膜中Sclerostin的表達在壓力側與張力側較對照組相比均增加，同時，5 d組和7 d組中Sclerostin的表達壓力側多于張力側（P<0.01）。提示在機械力的作用下，牙周膜細胞可能通過某種通路導致Sclerostin的表達增加。國外學者給予小鼠的尺骨持續施加機械力時，導致骨組織中Sclerostin的表達水平明顯降低[5]；尾部垂釣使小鼠后肢不受負荷，表現為骨組織中Sclerostin表達增多，Wnt/βcatenin信號活性降低[6]。國外學者[7]又證實在運動后血清中Sclerostin的含量下降。這些研究均表明Sclerostin的表達與機械刺激有關。然而，在正畸牙移動過程中，壓力側的牙周膜處于失去應力的狀態，而張力側牙周膜則受到張力的作用[8]。有學者[9]在加力1周后拆去第一磨牙的加力裝置，然后持續1周，結果發現其壓力側與張力側的Sclerostin表達均有增加，且含量高于持續加力組。所以可以合理地推斷，由于大鼠切牙生長的特殊性，加力裝置的固位易于因切牙的磨耗而脫落，盡管實驗過程中每天檢查3次修補脫落的加力裝置以盡量減少誤差，但是仍不可避免由于裝置的脫落，而導致的拉力側表達增加。

本研究結果還顯示，牙周膜中Sclerostin的表達和牙周組織中的破骨細胞均先逐漸增加，至5 d達到峰值，隨后逐漸地減少，14 d時Sclerostin的表達減少到接近3 d水平，推測原因可能有以下兩種：一是由于Sclerostin和Noggin可競爭性與骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）結合并抑制其作用[10]。骨改建過程是骨吸收與骨形成的動態平衡，二者同時進行。BMP促進骨形成的作用已經廣泛得到證實，而Noggin作為其最具親和力的一種細胞外拮抗劑，可特異性地被細胞表面的BMP受體結合來拮抗BMP的作用[11]。在正畸力的持續作用下，BMP的表達趨勢逐漸增加至5 d出現峰值，隨后逐漸下降，且張力側多于壓力側[12]，進而誘導其負反饋調節劑Noggin合成，但表達較BMP稍顯延遲，7 d時達到峰值，以抑制其過度表達。因此推測Sclerostin同BMP的分泌接近同步，而被延遲分泌的Noggin抑制，三者共同參與骨改建的調節，綜合表現為壓力側骨吸收，張力側骨形成；二是Sclerostin通過抑制Wnt/ β-catenin信號通路抑制骨形成[6]。Sclerostin在胚胎發育早期時可以抑制Wnt，通過結合低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）-5/6受體以及破壞由Wnt誘導的Frizzled-LRP復合體形成而抑制Wnt蛋白的形成[13]，調節骨量[14]。對敲除SOST基因的小鼠進行尾部懸吊，發現Wnt/β-catenin信號通路活性未降低，也未產生骨喪失現象；缺乏LRP-4的成骨細胞系表現為Sclerostin表達增加，證實是由于解除了對Wnt/β-catenin信號通路的抑制和Sclerostin對核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）含量變化的感應，LRP-4在成骨細胞系中通過作為Sclerostin的受體反向調節Wnt/β-catenin信號通路和促進RANKL誘導的破骨細胞形成[15]。由此可見，Sclerostin可以通過直接或間接調控BMP和抑制Wnt/ β-catenin信號通路參與正畸牙移動頜骨改建過程。

3.3臨床意義及展望

目前臨床上對促進骨改建的療法較少。由于Sclerostin具有抑制骨形成的作用，故推測其抗體可能具有促進骨形成的作用。有學者[16]將螺釘植入大鼠脛骨，注射Sclerostin抗體后進行拉力測試，發現骨小梁厚度和骨體積分數較對照組有所增加，證實Sclerostin抗體在骨改建時可以增加骨形成。Sclerostin抗體的臨床應用正在進行探索，希望在調控骨改建、牙齒移動速度和提高骨量方面能有所應用，為正畸和種植等技術提供新的思路，為臨床干預治療奠定了一定的理論基礎。

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（本文編輯杜冰）

Sclerostin expression in periodontal ligaments during movement of orthodontic teeth in rats

Chen Yiwen1, Gao Shang1,

Xu Tongtong1, Zhang Jiahui1, Li Jincheng1, Li Jincheng1, Zhang Huiyan1, Lu Jinjin1, Hu Min1, Liu Zhihui2.(1.Dept.of Orthodontics, School of Stomatology, Jilin University, Changchun 130012, China;2.Dept.of Prosthodontics, School of Stomatology, Jilin University, Changchun 130012, China)

[Key words]Sclerostin;periodontal ligament;orthodontic tooth movement

[Abstract]ObjectiveThis study aims to observe the expression of Sclerostin during movement of orthodontic teeth and determine the effect of this protein on remodeling of periodontal tissues.Methods Twenty-four Wistar rats were chosen.Orthodontic forces were applied between the bilateral incisor and first molar to achieve mesial movement.Rats in each group were executed at different time points (0, 1, 3, 5, 7, 14 d).Morphology of periodontal tissue was observed by hematoxylineosin(HE) staining.The number of osteoclasts were observed by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining.Sclerostin expression were observed by immunohistochemical staining.Results HE staining revealed that the resorption of alveolar bone intensified with prolonged movement.Results of immunohistochemical and TRAP staining revealed that Sclerostin expression and number of osteoclasts were related to duration of movement of orthodontic tooth.After staining for 5 days, the number of osteoclasts and Sclerostin expression reached their peak and then began to decline.The numbers of osteoclasts and the expression level of Sclerostin were higher at the compressive side than those at the tensive side.ConclusionSclerostin affected orthodontic tooth movement by inhibiting the Wnt signaling pathway and by indirectly or directly controlling bone morphogenetic protein.

[中圖分類號]R 783.5

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.005

[收稿日期]2015-12-01； [修回日期]2016-03-05

[基金項目]國家自然科學基金（81470764）；吉林省科技廳重點科技攻關科技計劃（20140204066SF）；大學生創新創業訓練計劃（2-013B78356）

[作者簡介]陳一文，學士，E-mail：397329354@qq.com

[通信作者]胡敏，教授，博士，E-mail：humin@jlu.edu.cn