牙齦卟啉單胞菌合成環二腺苷酸的高效液相色譜-串聯質譜法定性分析

譚詠梅　楊小軍　杜娟　趙望泓　陳曉丹　侯晉.南方醫科大學南方醫院口腔科；.南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院衛生監測中心，廣州 5055；.汕頭大學醫學院第二附屬醫院口腔科，汕頭 5504

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牙齦卟啉單胞菌合成環二腺苷酸的高效液相色譜-串聯質譜法定性分析

譚詠梅1楊小軍1杜娟2趙望泓1陳曉丹3侯晉1
1.南方醫科大學南方醫院口腔科；2.南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院衛生監測中心，廣州 510515；3.汕頭大學醫學院第二附屬醫院口腔科，汕頭 515041

[摘要]目的定性檢測牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）是否能產生細菌信號分子環二腺苷酸（c-di-AMP），為探索其在P.gingivalis生命代謝以及牙周炎免疫中的作用奠定基礎。方法以P.gingivalis標準菌株ATCC33277為實驗菌株，抽提細菌內核酸物質作為樣品，配置c-di-AMP標準品，通過高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）和高效液相色譜法（HPLC）對樣品進行驗證。結果HPLC-MS/MS檢出限按照信噪比（S/N）3∶1計算，c-di-AMP標準品出峰的保留時間為7.49 min，P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82 min時有目標峰出現（大于3 S/N）。HPLC檢測結果表明，P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標準品均在15.7 min處出現目標峰，且二者的紫外吸收光譜相同。結論牙齦卟啉單胞菌核酸提取物中含有c-di-AMP，牙齦卟啉單胞菌可以合成產生c-di-AMP。

[關鍵詞]環二腺苷酸；牙齦卟啉單胞菌；高效液相色譜-串聯質譜法

Supported by: National Natural Science Foundation of China (81500870);President Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2013Z006, 2012C005).Correspondence: Hou Jin, E-mail: houjin@smu.edu.cn.

環二鳥苷酸[bis-（3’-5’）-cyclic dimeric guano-sine monophosphate，c-di-GMP]和環二腺苷酸[bis-（3’-5’）-cyclic dimeric adenosine monophosphate，c-di-AMP]是近年來新發現的，在細菌和古細菌中廣泛存在的信號分子[1-2]。目前的研究結果顯示，c-di-GMP作為第二信使，在細菌的蠕動、毒力因子的表達、生物膜的形成、細胞周期、細胞間通訊以及細菌對宿主細胞的入侵等過程中發揮著重要的調節作用，是細菌生存和代謝的關鍵性調節因子之一[3-5]。與c-di-GMP相比，c-di-AMP的發現較晚，研究相對較少，因此對其功能了解十分有限。現有研究結果顯示，c-di-AMP與細菌肽聚糖穩態、細胞耐藥性、細菌大小、生物膜形成、肺炎鏈球菌菌鏈的長度以及細菌感染有著密切的關系，并且其在不同的菌種中發揮著不同的調節功能[6]。

c-di-AMP是通過二腺苷酸環化酶（diadenylate cyclase，DAC）由兩分子的ATP或ADP合成而來，而其降解代謝與c-di-GMP一樣都是通過磷酸二酯酶來完成。2008年Witte等[7]在研究細菌的Checkpoint 蛋白DisA的過程中發現，該蛋白結構中有一個未知功能的結構域147（domain of unknown function 147，DUF147），其具有二腺苷酸環化酶的活性，能將兩分子的ATP合成一分子的環二磷酸腺苷，因此該結構域又被命名為DAC結構域。由于該結構域多耦聯于DisA蛋白中，并且位于DisA蛋白的氨基端，所以又被稱為DisA_N結構域。Pfam數據庫中的數據顯示，11 352個物種中都含有DisA_N結構域。說明c-di-AMP這個信號分子在細菌中廣泛存在。通過常規的生物學方法敲除c-di-AMP的合成蛋白基因會導致多種細菌死亡，提示c-di-AMP在細菌的生命代謝過程中發揮著重要作用，是細菌生長所必需的信號分子。除此之外，c-di-AMP還可以作為病原相關的分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被宿主細胞內的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）特異性識別，激活宿主的固有免疫應答反應[2]。

雖然研究者已經在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[8]、李斯特菌（Listeria monocytogenes）[9]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[10]以及乳酸球菌（Lactococcus lactis）[11]等細菌的核酸提取物中檢測到了c-di-AMP的存在，但有關牙周炎致病菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）中c-di-AMP的研究迄今為止未見報道。本研究的目的是通過高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）定性檢測P.gingivalis是否能產生細菌信號分子c-di-AMP，為探索c-di-AMP在P.gingivalis生命代謝以及牙周炎免疫中的作用奠定基礎。

1　材料和方法

1.1實驗細菌

P.gingivalis ATCC 33277菌株購自美國Microbiologics公司。

1.2主要試劑及儀器

胰酶大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）培養基、L-鹽酸半胱氨酸、氯化血紅素、維生素K3（Sigma公司，美國），無菌脫纖維綿羊血（廣州蕊特生物科技有限公司），c-di-AMP標準品（Invivogen公司，美國），色譜純甲醇、乙腈（Merck公司，德國）。

Anoxomat Mark Ⅱ厭氧微需氧培養系統（MART公司，荷蘭），電子天平（Sartorius公司，德國），正置相差顯微鏡及照相系統（Olympus公司，日本），生物安全柜（上海振陽設備有限公司），離心機（Thermo公司，美國），AB4000液相色譜串聯質譜聯用儀（MDS Sciex公司，美國），氮吹儀（Organomation公司，美國），API 4000 QTrap HPLC-MS/ MS聯用儀配有Agilent1200高效液相色譜（Agilent Technologies公司，美國），Shim-pack XR-ODS色譜柱（島津公司，日本），Phenomenex C-18色譜柱（Phenomenex公司，美國）。

1.3細菌培養

將P.gingivalis ATCC33277復蘇后接種于TSB血瓊脂培養基（含50 mL·L-1凍溶羊血、0.5 g·L-1L-鹽酸半胱氨酸、5 mg·L-1氯化血紅素和1 mg·L-1維生素K3），37 ℃厭氧培養（80%N2、10%CO2、10%H2）。

1.4樣品的提取與純化

樣品提取的方法參考文獻[12-13]。取5 mL對數生長期（OD690≈0.8）的細菌菌液，4 ℃、2 500 g離心20 min，棄上清，加入1 mL的培養基重懸細菌沉淀物，4 ℃、2 500 g離心20 min，棄上清，往沉淀中加入300 μL的提取液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1），冰上孵育15 min，放入95 ℃加熱10 min后立即在冰上冷卻，4 ℃、20 800 g離心10 min，將上清轉移到另一支2 mL的離心管中。再往細菌沉淀物中加入200 μL的提取液，冰上孵育15 min，4 ℃，20 800 g離心10 min，收集上清（該步驟重復2次）。將所獲得的上清-20 ℃冷凍過夜。次日，4 ℃、20 800 g離心10 min，收集上清。將獲得的核酸提取物樣品在氮氣流中吹干，用甲醇復溶，上機檢測。

1.5c-di-AMP標準品溶液的配制

在c-di-AMP標準品中加入1 mL色譜級甲醇，溶解，混勻，配置成1 mg·mL-1的儲存液。將標準品儲存液用色譜級水稀釋，配成10 ng·mL-1和100 ng·mL-1的標準品溶液。

1.6HPLC-MS/MS檢測

采用HPLC-MS/MS檢測樣本和標準品。1）環境條件：溫度15～30 ℃，相對濕度小于等于80%。2）色譜條件。色譜柱：島津Shim-pack XR-ODS （75 mm×2.0 mm）；流動相：甲醇作為有機相，10 mmol·L-1的醋酸銨加0.1%醋酸作為水相；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：室溫；進樣量：5 μL。質譜條件見表1；離子源為ESI源，多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式，噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度350 ℃，氣簾氣15.0 kPa，離子源氣體12.0 kPa。

表1　c-di-AMP的質譜檢測條件Tab 1　Mass spectrometry conditions of c-di-AMP

1.7HPLC檢測

采用HPLC對樣品和標準品進一步驗證。1）環境條件。溫度：15～30 ℃，相對濕度小于等于80%。2）色譜條件。色譜柱：Phenomenex C-18（150 mm× 4.60 mm）；體系：采用A和B雙泵系統，流動相A相為10%乙腈+0.1%甲酸，B相為90%乙腈；流量：1.000 mL·min-1；低壓限值：0.00 bar；高壓限值：400.00 bar；梯度洗脫程序：0～20 min，A：20.0%，B：80.0%；21～24 min，A：0.0%B：100.0%；25～ 30 min，A：95.0%，B：5.0%。柱溫：室溫；進樣量：30.00 μL。HPLC結果以保留時間和紫外吸收光譜定性，即通過將c-di-AMP標準品的保留時間與P.gingivalis核酸提取樣品進行比對，再結合相應的光譜曲線，對樣品進行定性分析。

2　結果

2.1生物信息學檢索

通過生物信息檢索發現，在已知基因序列的P.gingivalis菌株中具有腺苷酸環化酶活性的DisA_N結構域（表2）。已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA均包含255個氨基酸。在美國國家生物技術信息中心數據庫（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中對已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA氨基酸序列進行比對發現，ATCC33277、TDC60和F0569的DisA蛋白具有完全相同的氨基酸序列，而其余8個菌株的DisA的氨基酸序列完全相同（表2）。氨基酸序列之間的相似性為99%，兩者之間只是羧基末端的第252位氨基酸不同，但DisA_N結構域的區域為8～249位氨基酸，因此該差異氨基酸并不位于DisA_N結構域內。

表2　牙齦卟啉單胞菌不同菌株中DisA蛋白的基因位點及其所編碼的蛋白Tab 2　Locus and protein of DisA of P.gingivalis strains

2.2HPLC-MS/MS檢測

HPLC-MS/MS檢測結果見圖1。HPLC-MS/MS檢出限按照信噪比（S/N）3∶1計算，c-di-AMP標準品出峰的保留時間為7.49 min，P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82 min時有目標峰出現（大于3 S/N），而且提取物中含有與標準品分子量一致的物質。這表明，P.gingivalis的菌體核酸提取物中含有c-di-AMP。

圖1　牙齦卟啉單胞菌提取物的HPLC-MS/MS檢測結果Fig 1　HPLC-MS/MS results of samples from P.gingivalis

2.3 HPLC檢測

HPLC檢測結果見圖2。P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標準品均在15.7 min處出現目標峰，且二者的紫外吸收光譜相同。這表明，樣品中含有與標準品為同一物質的c-di-AMP。

圖2　c-di-AMP標準品和牙齦卟啉單胞菌提取物樣品的高效液相色譜檢測結果Fig 2 HPLC results of c-di-AMP standard and nucleotide samples from P.gingivalis

3　討論

c-di-AMP是細菌中廣泛存在的環二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs）信號分子，由兩分子的ATP或ADP在二腺苷酸環化酶的作用下合成而來。Pfam數據庫中的數據顯示，11 352個物種中的12 702種蛋白都含有具有二腺苷酸環化酶活性的DAC結構域即DisA_N結構域。該結構域常常與其他功能的結構域偶聯在一起，而且不同功能結構域的組合方式已經發現的有21種之多，如DNA結合功能域、跨膜信號肽、PAS功能域、蛋白激酶功能域、磷酸化功能域以及功能未知的蛋白功能域等，說明c-di-AMP在細菌的生命代謝過程中扮演著多重角色。本研究通過生物信息檢索發現在已知基因序列的牙齦卟啉單胞菌的菌株中皆存在DisA_N結構域，該結果表明牙周致病菌P.gingivalis可能會合成和分泌c-di-AMP。本

研究以P.gingivalis標準株ATCC33277為實驗菌株，通過HPLC-MS/MS定性檢測P.gingivalis菌體提取物中是否存在c-di-AMP。實驗結果顯示，檢出限按照信噪比（S/N）3︰1計算，濃度為10 ng·mL-1 的c-di-AMP標準品出峰的保留時間為7.49 min，P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82 min時有目標峰出現（大于3 S/N）。因此，考慮P.gingivalis核酸提取物中可能含有c-di-AMP。由于樣品與標準品出峰時間的差異，筆者采用HPLC法對樣品和標準品進行進一步的驗證。本研究采用乙腈和甲酸對樣品進行等梯度洗脫，HPLC結果以保留時間和紫外吸收光譜定性，即通過將P.gingivalis核酸提取樣品的保留時間與c-di-AMP標準品進行比對，再結合相應的光譜曲線，對該樣品進行定性分析。結果顯示：P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標準品均在15.7 min處出現目標峰，而且樣品與標準品峰的紫外吸收光譜相同，因此，可以認為P.gingivalis核酸提取物中含有c-di-AMP，即P.gingivalis可以合成和分泌c-di-AMP。

色質聯用法在檢測分析過程中還存在色譜條件優化的問題，在本研究中，c-di-AMP標準品及牙齦卟啉單胞菌核酸提取物樣品兩者出峰時間不同，可能是受到了基質干擾、流動相、色譜柱以及實驗環境等多方面的影響，檢測條件還需進一步優化。

c-di-AMP作為細菌重要的信號分子，研究顯示：過量的c-di-AMP可干擾枯草芽孢桿菌肽聚糖的合成[8]；在金黃色葡萄球菌和乳酸球菌中，菌胞內cdi-AMP水平的升高可幫助細菌適應極端環境[10-11]，而且菌胞內c-di-AMP水平的升高有助于金黃色葡萄球菌的生長和分裂，這表明其在細菌的生命代謝過程中發揮著重要作用。c-di-AMP除了在細菌的生命代謝過程中扮演第二信使的角色外，還可被細胞內的某些DNA受體類的PRRs識別，調節干擾素（interferon）-β介導的免疫反應的活性，引發宿主的固有免疫反應[14-17]。入侵到宿主細胞內的細菌所產生的c-di-AMP可以被宿主細胞胞漿內的一類PRRs所感知，并激活宿主細胞的Ⅰ型干擾素反應[9]。本研究證明了牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌可合成c-di-AMP，但是c-di-AMP在其生命代謝中的作用，以及入侵到宿主細胞內的P.gingivalis所產生的c-di-AMP是否能激活宿主的Ⅰ型干擾素反應，并在牙周炎的免疫應答反應中發揮作用，還有待于進一步的深入研究。

[參考文獻]

[1]Ryjenkov DA, Tarutina M, Moskvin OV, et al.Cyclic diguanylate is a ubiquitous signaling molecule in bacteria: insights into biochemistry of the GGDEF protein domain[J].J Bacteriol, 2005, 187(5):1792-1798.

[2]R?mling U.Great times for small molecules: c-di-AMP, a second messenger candidate in Bacteria and Archaea[J].Sci Signal, 2008, 1(33):e39.

[3]Schirmer T, Jenal U.Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling[J].Nat Rev Microbiol, 2009, 7(10): 724-735.

[4]Mills E, Pultz IS, Kulasekara HD, et al.The bacterial second messenger c-di-GMP: mechanisms of signalling[J].Cell Microbiol, 2011, 13(8):1122-1129.

[5]Povolotsky TL, Hengge R.‘Life-style’ control networks in Escherichia coli: signaling by the second messenger c-di-GMP[J].J Biotechnol, 2012, 160(1/2):10-16.

[6]Corrigan RM, Gründling A.Cyclic di-AMP: another second messenger enters the fray[J].Nat Rev Microbiol, 2013, 11 (8):513-524.

[7]Witte G, Hartung S, Büttner K, et al.Structural biochemistry of a bacterial checkpoint protein reveals diadenylate cyclase activity regulated by DNA recombination intermediates[J].Mol Cell, 2008, 30(2):167-178.

[8]Mehne FM, Gunka K, Eilers H, et al.Cyclic di-AMP homeostasis in bacillus subtilis: both lack and high level accumulation of the nucleotide are detrimental for cell growth[J].J Biol Chem, 2013, 288(3):2004-2017.

[9]Woodward JJ, Iavarone AT, Portnoy DA.c-di-AMP secreted by intracellular Listeria monocytogenes activates a host type Ⅰinterferon response[J].Science, 2010, 328(5986):1703-1705.

[10]Corrigan RM, Abbott JC, Burhenne H, et al.c-di-AMP is a new second messenger in Staphylococcus aureus with a role in controlling cell size and envelope stress[J].PLoS Pathog, 2011, 7(9):e1002217.

[11]Smith WM, Pham TH, Lei L, et al.Heat resistance and salt hypersensitivity in Lactococcus lactis due to spontaneous mutation of llmg_1816 (gdpP) induced by high-temperature growth[J].Appl Environ Microbiol, 2012, 78(21):7753-7759.

[12]Burhenne H, Kaever V.Quantification of cyclic dinucleotides by reversed-phase LC-MS/MS[J].Methods Mol Biol, 2013, 1016:27-37.

[13]Spangler C, B?hm A, Jenal U, et al.A liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry method for quantitation of cyclic di-guanosine monophosphate[J].J Microbiol Methods, 2010, 81(3):226-231.

[14]Ishikawa H, Barber GN.STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling[J].Nature, 2008, 455(7213):674-678.

[15]Jin L, Hill KK, Filak H, et al.MPYS is required for IFN response factor 3 activation and typeⅠ IFN production in the response of cultured phagocytes to bacterial second messengers cyclic-di-AMP and cyclic-di-GMP[J].J Immunol, 2011, 187(5):2595-2601.

[16]Holm CK, Paludan SR, Fitzgerald KA.DNA recognition in immunity and disease[J].Curr Opin Immunol, 2013, 25 (1):13-18.

[17]McWhirter SM, Barbalat R, Monroe KM, et al.A host type Ⅰinterferon response is induced by cytosolic sensing of the bacterial second messenger cyclic-di-GMP[J].J Exp Med, 2009, 206(9):1899-1911.

（本文編輯 李彩）

·綜述·

Qualitative analysis of bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate of Porphyromonas gingivalis by high per-formance liquid chromatography coupled with mass spectrometry

Tan Yongmei1, Yang Xiaojun1, Du Juan2, Zhao Wanghong1, Chen Xiaodan3, Hou Jin1.(1.Dept.of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;2.Hygiene Detection Center, School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;3.Dept.of Stomatology, The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

[Key words]bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate;Porphyromonas gingivalis;high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry

[Abstract]Objective To test whether Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis) could produce bacterial signal molecule, bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate (c-di-AMP) and lay the foundation for explorations of its roles in life metabolism and periodontitis immunity of P.gingivalis.MethodsP.gingivalis standard strain ATCC33277 was used as the experimental strain to extract nucleic acids from the bacteria.Then, c-di-AMP was detected using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS/MS).Subsequently, HPLC was used to validate the sample further.ResultsBased on the signal/noise (S/N) for 3∶1, the limit of determination of HPLC-MS/MS for peak time of c-di-AMP standard substances was 7.49 min and nucleic acid extractions from P.gingivalis was 8.82 min (S/N>3).Further confirmation of HPLC showed that nucleic acid extractions from both P.gingivalis and c-di-AMP standard substances presented goal absorbent peaks at 15.7 min, with the same ultraviolet absorbent spectrum.ConclusionThe nucleic acid extractions from P.gingivalis contained c-di-AMP, which shows that P.gingivalis could produce c-di-AMP.

[中圖分類號]R 780.2

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.018

[收稿日期]2015-10-16； [修回日期]2016-02-18

[基金項目]國家自然科學基金（81500870）；南方醫科大學南方醫院院長基金（2013Z006，2012C005）

[作者簡介]譚詠梅，碩士，E-mail：yobecute@126.com

[通信作者]侯晉，講師，博士，E-mail：houjin@smu.edu.cn