調控血紅素加氧酶-1誘導K562A02細胞增殖、凋亡及耐藥機制研究*

柴其翔，韋四喜，王婭婷，方　琴，王季石△

(1.貴陽醫學院附屬醫院血液科；2.貴陽醫學院附屬白云醫院藥劑科，貴州貴陽 550004)

?

調控血紅素加氧酶-1誘導K562A02細胞增殖、凋亡及耐藥機制研究*

柴其翔1，韋四喜1，王婭婷1，方琴2，王季石1△

(1.貴陽醫學院附屬醫院血液科；2.貴陽醫學院附屬白云醫院藥劑科，貴州貴陽 550004)

[摘要]目的通過血紅素加氧酶-1(HO-1)誘導劑Hemin及抑制劑ZNPP IX調控HO-1，并聯合阿霉素逆轉K562A02細胞化療耐藥機制的研究，為慢性髓系白血病(CML)的逆轉耐藥提供新的策略。方法培養K562及K562A02細胞，采用熒光原位雜交(FISH)法檢測K562A02細胞中bcr-abl融合基因表達。分別用HO-1誘導劑Hemin及抑制劑ZNPP IX調控HO-1基因表達聯合阿霉素處理K562A02細胞后；流式細胞術檢測藥物誘導細胞凋亡情況。Western blot檢測耐藥相關基因及凋亡基因蛋白表達水平。結果K562A02細胞中bcr-abl融合基因陽性細胞占94%。阿霉素處理細胞后，隨著阿霉素濃度的增加，HO-1表達下降，耐藥相關基因MDR1、NF-κB(P65)、MRP1、TopoⅡα、ABCD2表達亦降低；用HO-1誘導劑Hemin、抑制劑ZNPP IX、阿霉素單藥分別及聯合處理K562A02細胞后，顯示HO-1高表達后耐藥相關基因表達升高，細胞凋亡率下降。而降低HO-1表達，耐藥相關基因表達下降，細胞凋亡率增加。結論HO-1可作為逆轉耐藥的靶基因，可以使K562A02對阿霉素重新敏感，起到增敏效應。

[關鍵詞]白血病，髓系，慢性；bcr-abl融合基因；阿霉素；K562；K562A02；血紅素加氧酶-1

慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種起源于造血干細胞的獲得性克隆性疾病。目前為止，絡氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)伊馬替尼(imatinib，IM)仍然是治療CML的首選藥物。然而，部分CML患者在IM治療后不久復發，表明耐藥已成為影響IM治療CML的重要問題。阿霉素，其作為周期非特異性藥物，對合成RNA的抑制作用很強,可以廣泛作用于多種腫瘤，均可殺滅各種生長周期的腫瘤細胞[1]。常用于血液腫瘤治療，在使用阿霉素治療血液腫瘤時，阿霉素通過P-糖蛋白(P-gp)在細胞內聚集和異常分布，從而降低藥物敏感性，產生耐藥。白血病細胞多藥耐藥的發生、發展為白血病化療成功與否的主要障礙。因此,逆轉阿霉素耐藥是提高化療療效，延長生存期的手段之一。有研究報道，逆轉阿霉素耐藥的主要方法有：多重耐藥(MDR)逆轉劑如環孢霉素及類似物SDZPSC833和抗癌藥新劑型等[2]，聯合兩種及兩種以上藥物等增加細胞對藥物的敏感性，都是通過抑制細胞中耐藥相關基因mdr-1及P-gp的表達，從而達到逆轉耐藥目的。下調P-gp 的表達是逆轉阿霉素耐藥的最直接、最根本的方法[3-5]。本研究利用血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)誘導劑Hemin及抑制劑ZNPP調控 HO-1，研究調控HO-1誘導K562A02對細胞增殖、凋亡及逆轉耐藥可能的分子作用機制，探討白血病治療新途徑。

1材料與方法

1.1材料polybrene購自Sigma-Aldrich公司。人CML細胞株K562、人CML耐阿霉素細胞株K562A02由貴陽醫學院附屬醫院造血干細胞移植中心實驗室凍存。阿霉素購自浙江海正藥業公司，TRIzol、逆轉錄試劑盒均為美國Invitrogen公司產品。MTT、DMSO為賽蘭博科技有限公司產品。RPMI-1640培養基、胎牛血清購自杭州四季青公司，AnnexinV-FITC/PI試劑盒(凱基生物)、β-actin一抗及二抗購自碧云天生物技術研究所。核因子-κB(NF-κB)、拓樸異構酶Ⅱα(TopoⅡα)、ABCD2、MRP1及凋亡相關基因Caspace3、8、9、一抗購自上海晶天生物技術有限公司，HO-1一抗購自北京博奧森生物科技有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養人CML細胞系K562及K562A02細胞培養使用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基中。37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度CO2培養箱培養，細胞接種密度(4～5)×105個/mL。使用處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2熒光原位雜交(FISH)法檢測K562A02細胞中bcr-abl融合基因收集待測細胞，PBS洗滌2次并以0.075 mol/L氯化鉀低滲，用甲醇∶冰乙酸(3∶1)連續固定3次，制片，計數1 000個間期細胞，記錄雜交信號。正常間期細胞將顯示隨機分散的2紅2綠4個雜交信號，異常則出現1紅1綠2融合的雜交信號。

1.2.3細胞凋亡率檢測取對數生長期的K562A02細胞，調整細胞密度2×105個/mL，接種于6孔板，每孔1 mL，同時設置空白對照組、慢病毒上調HO-1組、慢病毒沉默HO-1組。培養24 h后，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μL膜聯蛋白V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入190 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測，每組平行實驗3次。

1.2.4Western blot檢測收集各組細胞，提取細胞總蛋白。每份樣本取40 μg總蛋白，經10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉移至醋酸纖維素膜上，經封閉液封閉過夜后加鼠抗人β-actin一抗(1∶500)，兔抗人HO-1一抗(1∶1 000)，兔抗人MDR1一抗(1∶500)，兔抗人MRP1一抗(1∶500)，兔抗人TopoⅡα一抗(1∶1 000)，鼠抗人ABCD2一抗(1∶800)，鼠抗人NF-κB一抗(1∶500)室溫搖膜90 min，后TBST洗膜，分別加入羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)及羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育60 min，TBST洗膜后用ECL試劑染色后曝光。每個實驗至少重復3次。

1.2.5細胞分組及檢測為了證實HO-1在阿霉素促進K562AO2細胞凋亡及逆轉耐藥中發揮重要的作用，了解調控HO-1表達后對阿霉素誘導細胞凋亡和逆轉耐藥的影響，將細胞分為6個組，空白組(未處理組)，Hemin組(Hemin 10 μmol/L處理)，ZnPP IX組(ZnPP IX 10 μmol/L處理)，阿霉素組(32 μg/mL阿霉素單獨處理)，阿霉素+Hemin組(32 μg/mL阿霉素+10 μmol/L Hemin聯合處理)，阿霉素+ZnPP IX組(32 μg/mL阿霉素+10 μmol/L ZnPP IX聯合處理)。Western blot檢測不同分組處理K562A02細胞后 HO-1、Caspase9、Caspase3、Caspase8、MDR1、TopoⅡα、MRP1及NF-κB基因蛋白的表達。

1.3統計學處理采用SPSS15.0軟件進行統計分析，組間比較采用方差分析及LSDt檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1FISH法檢測K562A02細胞株bcr-abl融合基因表達K562A02細胞在FISH中表達為典型的t(9;22) (q34;q11)雜交信號(2融合)，bcr-abl融合基因陽性細胞占細胞總數的94%，見圖1。

綠色:ABL;紅色:BCR。

圖1FISH雙色雙融合探針法檢測BCR-ABL融合基因的熒光圖

2.2流式細胞術檢測阿霉素作用K562A02細胞后的細胞凋亡率阿霉素誘導K562A02細胞凋亡呈劑量依賴關系，K562A02細胞凋亡率隨著阿霉素濃度的增加而增加，在濃度為32 μg/mL時，作用濃度達到峰值。阿霉素8、16、32、64 μg/mL誘導K562A02細胞凋亡率分別為21.09%、30.05%、69.08%、64.65%，見圖2。

圖2　流式細胞術檢測不同濃度阿霉素處理K562A02細胞24 h后的細胞凋亡率

2.3Western blot檢測耐藥相關基因MDR1、NF-κB(P65)等蛋白的表達MDR1、NF-κB(P65)、MRP1、TopoⅡα、ABCD2及HO-1蛋白表達隨阿霉素濃度增高而減低，呈劑量依賴關系，64 μg/mL濃度點表達最低。以β-actin為內參，MDR1、NF-κB(P65)、MRP1、TopoⅡα、ABCD2及HO-1各蛋白表達隨阿霉素濃度增加而降低，在64 μg/mL時表達最低，與未處理組(0 μmol/L)比較，阿霉素8、16、32、64 μg/mL組蛋白表達降低(P<0.05)，見圖3。因流式細胞檢測凋亡，其作用濃度同Realtime-PCR濃度一致，故聯合使用藥物時，阿霉素作用濃度設為32 μg/mL。

2.4調控HO-1表達對阿霉素誘導細胞凋亡及細胞耐藥的影響調控HO-1表達后對耐藥及凋亡相關基因Caspase9、Caspase3、Caspase8、MDR1、TopoⅡα、MRP1及NF-κB蛋白表達水平的影響，凋亡相關基因蛋白表達水平在阿霉素+Hemin組表達最低，而阿霉素+ZnPP IX組表達最高。耐藥相關基因表達水平在阿霉素+Hemin組表達最高，而阿霉素+ZNPP組表達最低(圖4A)。與空白組(未處理組)比較，在ZNPP IX組和阿霉素組，細胞凋亡蛋白均有所增加，阿霉素+ZNPPIX組中，HO-1及耐藥相關基因蛋白表達水平最低，而凋亡蛋白表達水平最高。組間表達差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4B、C。

2.5調控HO-1表達后對K562AO2細胞凋亡率的影響阿霉素+Hemin組K562A02細胞的凋亡率最低，而阿霉素+ZnPP IX組的K562A02細胞凋亡率最高。空白組、阿霉素組、Hemin組、ZNPP IX組、阿霉素+Hemin組及阿霉素+ZnPP IX組的凋亡率分別為(8.71±1.09)%、(3.65±1.65)%、(36.78±0.95)%、(34.83±1.24)%、(18.83±1.52)%及(68.95±1.17)%;組間表達差異有統計學意義(P<0.05),見圖5。

圖3　不同濃度阿霉素處理K562A02細胞24 h后 MDR1、

A：電泳圖；B、C：以β-actin為內參，HO-1及耐藥、凋亡相關基因蛋白的相對表達直方圖；1：空白組；2：Hemin組；3：ZNPP組；4:阿霉素組；5：阿霉素+Hemin組；6：阿霉素+ZNPP IX組；a：P<0.05，與空白組比較。

圖4不同分組處理K562A02細胞后 HO-1及耐藥及凋亡基因的蛋白表達水平

圖5　流式細胞術檢測不同分組處理后K562A02細胞的凋亡率

3討論

HO-1 作為一種抗氧化防御酶在機體中廣泛存在，既往許多實驗結果都顯示誘導HO-1的表達是細胞對抗外界環境刺激的一種防御性的保護反應[6]。有研究發現多種類型人類腫瘤高表達HO-1，說明HO-1以一種特殊方式改變細胞的生長狀態，認為它可能是一種腫瘤細胞生長的促進因子[7]。仍有一部分患者出現病情復發或伴隨較差的預后,其主要原因是白血病細胞多藥耐藥的產生[8]，如何提高白血病細胞對化療的敏感性是白血病治療的關鍵所在。

阿霉素屬于TopoⅡ抑制劑,可通過抑制雙鏈DNA的合成來誘導腫瘤細胞的凋亡而發揮抗腫瘤作用。在CML治療中常出現阿霉素耐藥情況的發生。因此，在CML的治療中出現耐藥是影響獲得良好療效的主要障礙。阿霉素通過P-gp在胞內聚集和異常分布，從而降低藥物敏感性，產生耐藥。逆轉阿霉素耐藥的方式有聯合用藥等方式下調細胞mdr-1 mRNA 和P-gp 的表達以抑制P-gp 的功能。P-gp高表達，可以導致化療失敗或耐藥，其機制可能為可使作用藥物從細胞內通過泵泵出細胞外，細胞內藥物作用濃度變低，藥物對細胞的毒性降低[9]。

本課題使用HO-1作為靶基因，通過Hemin及ZNPP調控HO-1 表達同時聯合阿霉素作用于k562AO2細胞。其耐藥基因同HO-1表達呈現正相關性。因阿霉素的耐藥逆轉可促進細胞增殖抑制細胞凋亡增加血管新生受抑。故予HO-1作為逆轉阿霉素耐藥的分子靶點。隨著對HO-1在腫瘤發生發展過程中的作用更深入研究，近年來關于HO-1與腫瘤耐藥的相關研究已有報道，使得HO-1成為目前腫瘤耐藥研究的熱點之一[10]。并且本實驗室前期已證實了HO-1的高表達與CML的病情進展有關[11-13]可見，HO-1在腫瘤組織中多呈高表達與化療耐藥相關。本研究中阿霉素+Hemin組K562A02細胞的凋亡率較阿霉素單獨處理組降低，阿霉素+ZnPP IX組K562A02細胞的凋亡率明顯高于阿霉素組及阿霉素+Hemin組。結果說明阿霉素對K562A02細胞有促進凋亡作用，但HO-1高表達時，這種促進作用會受到抑制，而HO-1低表達時，K562細胞的凋亡率明顯升高，說明HO-1對K562A02細胞具有保護效應。

本課題組關于HO-1和白血病耐藥的研究也證實急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)患者中HO-1表達高于健康者，抑制HO-1表達可以增強AML細胞對化療的敏感性[14]。因此，抑制腫瘤細胞中HO-1表達，可能是逆轉阿霉素耐藥的新思路。多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP) 是ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC) 轉運蛋白主要成員,MRP通過結合ATP 泵，將藥物泵出細胞外來以降低細胞內藥物濃度來介導耐藥,其過度表達常常導致腫瘤MDR的產生[15]。由MDR-1編碼的P-gp是產生阿霉素耐藥的原因之一。但是在臨床治療中許多患者耐藥的發生并不能單一以MDR-1的過表達來解釋，MDR-1過度表達常常導致腫瘤多藥耐藥的產生，在不同細胞株的培養中均發現多種MRP蛋白高表達，且與抗腫瘤藥物的耐藥密切相關[16]。MRP1為膜轉運蛋白,它產生耐藥的機制是由于將抗腫瘤藥物泵出細胞膜外所致[17-18]。目前研究顯示，TopoII在腫瘤的多藥耐藥中發揮著重要作用，其耐藥機制為：(1)活性及酶量下降、表達缺失或基因突變，從而使抗癌藥的作用靶點減少或喪失；(2)通過參與其他耐藥基因的調控誘導其他耐藥基因的表達[19]。

綜上所述，阿霉素可抑制K562A02細胞增殖且誘導細胞凋亡。HO-1基因高表達時，在CML耐藥細胞凋亡過程中起保護作用，與促進CML耐藥細胞的生長有關。沉默HO-1基因，其耐藥基因相應的可通過MRP1、TopoⅡα、ABCD2、MDR1等信號通路逆轉K562A02耐藥。

參考文獻

[1]Laginha KM,Verwoert S,Charrois GJ,et al.Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors[J].Clin Cancer Res,2005,11(19 Pt 1):6944-6949.

[2]Han Z,Hong L,Han Y,et al.Phospho Akt mediates multidrug and Bax[J].J Exp Clin Cancer Res,2007,26(2):261-268.

[3]Lavie Y,Harel-Orbital T,Gaffield W,et al.Inhibitory effect of steroidal alkaloids on drug transport and multidrug resistance in human cancer cells[J].Anticancer Res,2001,21(2A):1189-1194.

[4]Naito M,Matsuba Y,Sato S,et al.MS-209,a quinoline-type reversal agent,potentiates antitumor efficacy of docetaxel in multidrug-resistant solid tumor xenograft models[J].Clin Cancer Res,2002,8(2):582-588.

[5]Cuvier C,Treupel R,Millot JM,et al.Doxo nanospheres bypass tumor cell multidru[J] Biochem Pharmacol,1992,44(3):509-517.

[6]Hanselmann C,Mauch C,Werner S.Haem oxygenase-1:a novel player in cutaneous wound repair and psoriasis?[J].Biochem J,2001,353(3):459-466.

[7]Otterbein LE,Soares MP,Yamashita K,et al.Heme oxygenase-1:unleashing the protective properties of heme[J].Trends Immunol,2003,24(8):449-455.

[8]Koistinen P,R?ty R,It?l? M,et al.Long-term outcome of intensive chemotherapy for adults with de novo acute myeloid leukaemia (AML):the nationwide AML-92 study by the Finnish Leukaemia Group[J].Eur J Haematol,2007,78(6):477-486.

[9]Wong HL,Bendayan R,Rauth AM,et al.Simultaneous delivery of doxorubicin and GG918 (Elacridar) by new polymer-lipid hybrid nanoparticles (PLN) for enhanced treatment of multidrug-resistant breast cancer[J].J Control Release,2006,116(3):275-284.

[10]Yu HM,Wang TC.Mechanism of cisplatin resistance in human urothelial carcinoma cells[J].Food Chem Toxicol,2012,50(5):1226-1237.

[11]王季石，楊暢，方琴，等．體外誘導K562細胞尼洛替尼耐藥及其機制的初步探討[J]．中華血液學雜志，2012，33(11)：906-910．

[12]陳埕，王季石，秦東，等．逆轉錄病毒介導的HO-1基因在尼洛替尼誘導K562/A02耐藥細胞凋亡中的作用[J]．中華血液學雜志，2012，33(5)：383-387．

[13]王季石，柴柏勝，方琴，等．HO-1基因表達對伊馬替尼耐藥的慢性髓系白血病細胞增殖的影響[J]．中華血液學雜志，2011，32(6)：388-391．

[14]MaD,FangQ,LiY,etal.Crucialrole

of heme oxygenase-1 in the sensitivity of acute myeloid leukemia cell line Kasumi-1 to ursolic acid[J].Anticancer Drugs,2014,25(4):406-414.

[15]Daood M,Tsai C,Ahdab-Barmada M,et al.ABC transporter (P-gp/ABCB1,MRP1/ABCC1,BCRP/ABCG2) expression in the developing human CNS[J].Neuropediatrics,2008,39(4):211-218.

[16]Kl?s J,Wolburg H,Terasaki T,et al.Characterization of immortalized choroid plexus epithelial cell lines for studies of transport processes across the blood-cerebrospinal fluid barrier[J],Cerebrospinal Fluid Research,2010,7(1)11.

[17]Kruh GD,Belinsky MG.The MRP family of drug efflux pumps[J].Oncogene,2003,22(47):7537-7552.

[18]Wei XL,Ni H,Wang QS,et al.Impact of STAT4 gene silencing on the expression profile of proteins in EL-4 cells[J].Chin Sci Bull,2009,54(18):3265-3270.

[19]Asano T,Zwelling LA,An T,et al.Effect of transfection of a Drosophila topoisomerase Ⅱ gene into a human brain tumour cell line intrinsically resistant to etoposide[J].Br J Cancer,1996,73(11):1373-1380.

Study on regulating heme oxygenase-1 for inducing proliferation,apoptosis and drug resistance mechanism of K562A02 cell*

ChaiQixiang1,WeiSixi1,WangYating1,FangQin2,WangJishi1△

(1.DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou,550004,China;2.DepartmentofPharmacy,AffiliatedBaiyunHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou,550004,China)

[Abstract]ObjectiveTo regulate heme oxygenase-1(HO-1) by the inducer Hemin of HO-1 and inhibitor ZNPP.IX and combined with adriamycin for reversing the chemotherapeutic drug-resistance mechanism of K562A02 cells so as to provide a new strategy for chemoresistance reversion of chronic myeloid leukemia (CML).MethodsK562 and K562A02 cells were cultured and the expression of bcr-abl fusion gene in K562A02 cells was detected by fluorescence in situ hybridization (FISH).Then the HO-1 gene expression was respectively regulated by Hemin as the HO-1 inducer and ZNPP as the inhibitor and adriamycin was combined for treating K562A02 cells with different concentrations.The apoptosis induced by medication was detected by flow cytometry.The expression levels of drug resistance related gene and apoptosis gene protein were detected by Western blot.ResultsThe positive cells of bcr-abl fusion gene in the K562A02 cells accounted for 94%.The HO-1 expression was decreased with the adriamycin concentration increase after treating cells by adriamycin,the expression levels of drug resistance related genes MDR1,NF-κB(P65),MRP1,TopoⅡα and ABCD2 were also decreased;after treating K562A02 cells by single drug and combination of Hemin,ZNPP.IX and adriamycin,increasing HO-1 expression elevated the expression of drug resistance related genes and decreased the cellular apoptosis,while reducing HO-1 expression could decrease the expression of drug resistance related genes and increased cellular apoptosis.ConclusionHO-1 can act as a target gene for drug resistance reversion and can make K562A02 cells to regain sensitivity to adriamycin,thus plays a sensitivity-increasing effect.

[Key words]leukemia,myelogenous,chronic;bcr-abl fusion gene positive;adriamycin;K562;K562A02;heme oxygenase-1

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.003

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81360501)。

作者簡介：柴其翔(1988-)，住院醫師，碩士研究生，主要從事常見白血病耐藥的機制研究。△通訊作者，Tel：13985704057；E-mail：chaiqixiang@163.com。

[中圖分類號]R552

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)06-0727-04

(收稿日期：2015-07-19修回日期：2015-10-24)