腸桿菌科細菌SDD菌株特征及替加環(huán)素藥敏結果分析*

鄒自英，劉　媛，曾　平，胡宗海，朱　冰，吳麗娟

(成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，四川成都 610083)

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腸桿菌科細菌SDD菌株特征及替加環(huán)素藥敏結果分析*

鄒自英，劉媛#，曾平，胡宗海，朱冰，吳麗娟△

(成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，四川成都 610083)

[摘要]目的分析醫(yī)院腸桿菌科細菌劑量依賴性敏感(SDD)菌株的藥物敏感性情況和檢出分布特征，并檢測產超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的敏感性，以指導臨床對SDD菌株的抗菌藥物及對ESBLs產酶株替加環(huán)素的選擇。方法采用VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析儀進行細菌鑒定及儀器法抗菌藥物敏感性試驗。對50株ESBLs陽性大腸埃希菌和50株肺炎克雷伯菌分別采用微量肉湯稀釋法、MTS測試條法、Vitek2儀器檢測法、紙片擴散法檢測替加環(huán)素的敏感性。結果采用M100-S24標準頭孢吡肟判斷為敏感的腸桿菌科細菌有3.58%～12.50%的菌株為SDD菌株；ESBLs陽性大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的SDD菌株檢出率分別為13.31%和 8.60%，顯著高于ESBLs陰性菌株(P<0.05)；所有腸桿菌科細菌SDD菌株最低抑菌濃度(MIC)4 mg/L菌株檢出率顯著高于SDD菌株MIC 8 mg/L菌株檢出率(P<0.05)；ESBLs陽性大腸埃希菌和肺炎克雷伯采用微量肉湯稀釋法和MTS測試條法的敏感率均為100%。結論當腸桿菌科細菌頭孢吡肟MIC 為4 mg/L或8 mg/L時，實驗室應在檢驗報告提示SDD菌株的檢出。替加環(huán)素對ESBLs陽性大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的敏感率為100%。

[關鍵詞]頭孢吡肟；劑量依賴性敏感菌株；替加環(huán)素；超廣譜β內酰胺酶

2014年美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)文件M100-S24首次對腸桿菌科細菌抗菌藥物頭孢吡肟引入了劑量依賴性敏感(susceptible-dose dependent,SDD)的概念，SDD概念的使用對于完善臨床微生物藥敏檢驗報告，避免臨床將“中介”作為“耐藥”的過渡進行處理，指導臨床合理使用抗菌藥物具有重要意義[1-2]。替加環(huán)素臨床上多用于高耐藥菌株引起的復雜性重癥感染性疾病的治療，如碳青酶烯耐藥的腸桿菌科細菌、泛耐藥的鮑曼不動桿菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌及耐萬古霉素的腸球菌等引起的感染性疾病的治療[3-5]。基于目前實驗室商品化檢測系統(tǒng)還未引入SDD概念，替加環(huán)素也未引入商品化腸桿菌科藥敏檢測卡，本研究通過分析2014年臨床送檢分離腸桿菌科細菌頭孢吡肟SDD菌株的檢出特征及產超廣譜β內酰胺酶(extended β-lactamases,ESBLs)菌株的替加環(huán)素藥物敏感情況，探討實驗室報告SDD菌株對臨床抗菌藥物選擇的指導意義及替加環(huán)素對ESBLs產酶株的抗菌活性。

表1　腸桿菌科細菌M100-S24和M100-S23折點頭孢吡肟藥敏結果比較[n(%)]

P:S(≤2)與S(≤8)敏感率比較。

1材料與方法

1.1材料(1)菌株來源：收集2014年1～10月臨床送檢分離腸桿菌科菌株共1 950株，同一患者同一部位重復分離菌株只計首次分離菌株檢測結果。標準菌株采用大腸埃希菌ATCC25922、霍氏腸桿菌ATCC 700323、肺炎克雷伯菌ATCC700603。(2)試劑與儀器： 替加環(huán)素藥敏紙片購自Oxoid公司，替加環(huán)素MTS條購自意大利Liofilchem公司，替加環(huán)素干粉購自美國輝瑞公司。GN鑒定卡、GN-13和GN-16藥敏檢測卡及VITEK2 COMPACT全自動微生物分析儀為法國梅里埃公司產品。

1.2方法

1.2.1頭孢吡肟最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)檢測方法采用法國梅里埃公司的VITEK 2 COMPACT儀器及AST-GN13藥敏檢測卡片檢測菌株的頭孢吡肟敏感性，菌株的鑒定采用GN卡進行鑒定。

1.2.2M100-S24和M100-S23腸桿菌科MIC折點變化M100-S24文件[1]規(guī)定腸桿菌科頭孢吡肟：MIC≤2 mg/L敏感(S)、MIC 4～8 mg/L SDD、MIC≥16 mg/L耐藥(R)，取消中介(I)的概念。M100-S23文件規(guī)定[6]腸桿菌科頭孢吡肟，S:MIC≤8 mg/L；Z:MIC 16 mg/L；R:MIC≥32 mg/L。

1.2.3替加環(huán)素藥敏折點由于替加環(huán)素尚無CLSI推薦的藥敏折點標準，本研究采用美國食品藥品管理局(FDA)推薦的對腸桿菌科細菌的稀釋法藥敏折點標準：S≤2 μg/mL，I為4 μg/mL，R≥8 μg/mL;紙片擴散法藥敏折點標準：S≥19 mm，I為15～18 mm,R≤14 mm。

1.2.4ESBLs確證試驗AST-GN13藥敏卡通過VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析儀檢測，提示ESBLs陽性的菌株按CLSI推薦的方法，將0.5麥氏單位菌液均勻涂布M-H平板，再將頭孢噻肟(30 μg)和頭孢噻肟/克拉維酸(30 μg/10 μg)、頭孢他啶(30 μg)和頭孢他啶/克拉維酸(30 μg/10 μg)粘貼在涂布菌液的M-H平板上，35 ℃培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑，兩對紙片或其中任何一對紙片的直徑相差大于或等于5 mm，即為產ESBLs菌株。

1.3統(tǒng)計學處理LIS系統(tǒng)導出的DBF格式數據，采用WHONET5.6軟件進行腸桿菌科細菌頭孢吡肟敏感性分析。DBF格式數據轉換為EXCELL格式數據，分別計數腸桿菌科細菌的MIC值分布范圍，依據新舊CLSI標準分別計算頭孢吡肟的敏感性狀況。兩組率的比較采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1腸桿菌科細菌M100-S24和M100-S23折點頭孢吡肟藥敏結果比較采用M100-S23和M100-S24標準進行判斷，所有腸桿菌科細菌對頭孢吡肟的敏感率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但采用M100-S24標準判斷為敏感的菌株，有3.58%～12.50%的菌株為SDD菌株，見表1。

2.2ESBLs陽性與陰性菌株SDD菌株檢出率比較大腸埃希菌共檢出ESBLs陽性菌株511株(57.94%)，其中SDD菌株68株；ESBLs陰性菌株371株(42.06%)，其中SDD菌株7株。肺炎克雷伯菌共檢出ESBLs陽性菌株 221株(37.71%)，其中SDD菌株19株；ESBLs陰性菌株365株(62.29%)，其中SDD菌株2株。大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs陽性菌株SDD菌株檢出率高于ESBLs陰性菌株(P<0.05)，見表2。

表2　ESBLs陽性與陰性菌株SDD菌株檢出率

2.3SDD菌株MIC值分布腸桿菌科各細菌SDD菌株MIC主要分布在4 mg/L(77.50%)，MIC 8 mg/L占22.50%，所有腸桿菌科細菌SDD菌株MIC 4 mg/L菌株檢出率顯著高于SDD菌株MIC 8 mg/L菌株檢出率(P<0.05)，見表3。

表3　SDD菌株MIC值分布[n(%)]

表4　不同檢測方法的替加環(huán)素藥敏檢測結果(%)

P:與微量肉湯稀釋法敏感率比較。

2.4ESBLs陽性菌株不同藥敏檢測方法替加環(huán)素藥敏結果分析采用微量肉湯稀釋法和MTS測試條法的敏感率均為100%，與微量肉湯稀釋法比較，大腸埃希菌紙片擴散法的敏感率顯著降低，肺炎克雷伯菌的VITEK儀器法和紙片擴散法敏感率顯著降低，見表4。

3討論

SDD是依賴于患者所用劑量的菌株敏感性，當菌株的MIC值或抑菌圈直徑在SDD規(guī)定的范圍時，臨床應當提高抗菌藥物的給藥方案，才能達到預期的臨床治療效果。理解SDD的含義需要與 “中介”進行區(qū)分，后者指MIC接近血液和組織中通常可達到的濃度，療效低于敏感菌株，表示藥物在生理濃集的部位具有臨床效力或可用高于正常劑量的藥物進行治療；另外，中介還可作為緩沖區(qū)，以防止微小的、未受控制的技術因素導致較大的錯誤結果，特別是毒性范圍窄的藥物[1]。藥敏試驗的中介已包括SDD的概念，CLSI M100-S24文件建議腸桿菌科頭孢吡肟藥敏試驗MIC為4、8 mg/L時采用SDD替代中介，因為頭孢吡肟有多種批準的劑量可供臨床選擇。

實驗室普遍采用的商品化微生物分析系統(tǒng)受產品認證、更新等因素的影響，常無法及時采用最新的判斷標準進行臨床報告和解讀。本研究采用M100-S24判斷為敏感的腸桿菌科細菌有3.58%～12.50%的菌株為SDD菌株[6]。采用M100-S23標準把頭孢吡肟MIC≤8 mg/L判斷為敏感時，推薦的劑量方案是1 g/8 h或2 g/12 h。而采用M100-S24進行判斷時，MIC≤2 mg/L為敏感，推薦劑量方案是1 g/12 h；MIC 為4 mg/L時，推薦劑量是1 g/8 h或2 g/12 h；MIC為8 mg/L時，推薦的劑量方案是2 g/8 h[1]。SDD概念的引入使得臨床的用藥方案更加詳細和具體。可見，目前實驗室使用的MIC≤8 mg/L敏感的標準沒有專門考慮SDD菌株需要提高給藥方案的問題，可能會導致臨床治療效果欠佳。而基于M100-S23或M100-S24進行報告發(fā)送，頭孢吡肟的敏感率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即并不會影響臨床醫(yī)生判斷是否可以選用頭孢吡肟，但會影響臨床用藥方案的制訂，從而影響治療效果。

大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌是臨床最常檢出的腸桿菌科細菌，產ESBLs是其常見的耐藥機制之一[7-8]。產ESBLs菌株呈現對青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類等多種藥物的耐藥性[9-11]。本研究比較了ESBLs產酶株和非產酶株的SDD菌株檢出率，發(fā)現ESBLs產酶株的SDD菌株檢出率顯著高于非產酶株，即臨床在使用頭孢吡肟治療ESBLs產酶株時提高藥物方案可能會取得較好的療效。雖然CLSI文件指出檢測ESBLs主要用于流行病學調查和醫(yī)院感染控制的目的，實驗室不用常規(guī)進行檢測[12]。本研究的結果提示，產ESBLs的SDD菌株的頭孢吡肟可能需要修改用藥方案，所以實驗室報告ESBLs及其注釋可以給臨床用藥提供必要的參考信息。

腸桿菌科各細菌SDD菌株MIC主要分布在4 mg/L，MIC 4 mg/L菌株檢出率顯著高于MIC 8 mg/L菌株檢出率。提示大部分SDD菌株采用1 g/8 h或2 g/12 h的劑量方案均可以取得較好的臨床療效，少部分SDD菌株需要采用2 g/8 h的更高劑量方案。實驗室準確檢測MIC值是非常重要的，若檢測抑菌圈直徑，則19～24 mm為SDD菌株，推薦采用2 g/8 h，因為抑菌圈直徑還不能與MIC進行一對一的關聯(lián)，只能視作8 mg/L處理[2]。而根據本研究的結果，SDD菌株大部分為MIC 4 mg/L，若檢測抑菌圈直徑則增加了用藥風險。

替加環(huán)素適應證為復雜性腹腔感染，臨床上用于多種細菌引起的各種重癥感染的治療[13-15]，由于臨床上常用于檢測腸桿菌科的藥敏檢測卡不包含替加環(huán)素，文獻報導替加環(huán)素的藥敏結果受檢測方法的局限[12]。本實驗證實替加環(huán)素對本院ESBLs菌株的抗菌活性達到100%，但實驗室如果采用非發(fā)酵菌藥敏卡或紙片擴散法檢測替加環(huán)素對腸桿菌科細菌的敏感性，中介和耐藥菌株需要使用MTS測試條進行進一步確認，若臨床確實有需要的患者可以采用微量肉湯法進行驗證，以確保替加環(huán)素得到正確選用。

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Characteristics of susceptible-dose dependent strains of Enterobacteriaceae bacteria and analysis of tigecycine sensitivity test results*

ZouZiying,LiuYuan#,ZengPing,HuZonghai,ZhuBing,WuLijuan△

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu,Sichuan610083,China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze the drug susceptibility situation of susceptible-dose dependent(SDD) strains of Enterobacteriaceae bacteria and the detection distribution characteristics,and to detect the susceptibilities of extended spectrum β-lactamases (ESBLs) producing Escherichia coli and Klebsiella pneumonia to tigecycline.MethodsThe bacterial identification and drug susceptibility test to antibacterial drugs were detected by adopting the VITEK 2 COMPACT automatic microbiological analyzer.The susceptibility test to tigecycline in 50 strains of ESBLs positive Escherichia coli and 50 strains of Klebsiella pneumonia were tested by the mini broth dilution method,minimum inhibitory concentration(MIC) test strip,VITEK 2 compact system and disk diffusion method,respectively.ResultsAccording to M100-S24 criteria,about 3.58%-12.50% of the Enterobacteriaceae strains susceptible to cefepime were SDD strains.For ESBLs positive Escherichia coli and Klebsiella pneumonia strains,the detection rate of SDD strains were 13.31% and 8.60% respectively,which were higher than those for ESBLs negative strains(P<0.05).Moreover,the detection rate of SDD Enterobacteriaceae strains for the MIC 4 mg/L was higher than that for MIC 8 mg/L (P<0.05);the sensitivity rate of ESBLs positive Escherichia coli and Klebsiella pneumonia to tigecycine by adopting the mini broth dilution method and the MIC test strip was 100%.ConclusionThe laboratory should prompt that the SDD strain is detected out in the inspection report when the cefepime MIC is 4 mg/L or 8 mg/L.The sensitivity rate of tigecycline to ESBLs positive Escherichia coli and Klebsiella pneumonia is 100%.

[Key words]cefepime;susceptible-dose dependent strains;tigecycline;extended spectrum β-lactamases

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.018

基金項目：四川省衛(wèi)生廳課題資助項目(130318)；成都軍區(qū)總醫(yī)院院管課題資助項目(2013YG-B069)。

作者簡介：鄒自英(1977-)，主管技師，醫(yī)學碩士，主要從事細菌耐藥機制研究。#共同第一作者：劉媛(1982-)，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士，主要從事病毒的致病機制研究。

[中圖分類號]R378

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)06-0779-03

(收稿日期：2015-06-12修回日期：2015-10-21)

△通訊作者，Tel：028-86571052；wulijuan1638@126.com。