基質金屬蛋白酶-2及Bax在人腦膠質瘤中的表達及意義

楊立軍

(承德醫學院附屬醫院神經外科，河北承德 067000)

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基質金屬蛋白酶-2及Bax在人腦膠質瘤中的表達及意義

楊立軍

(承德醫學院附屬醫院神經外科，河北承德 067000)

[摘要]目的觀察人腦組織中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和Bax的表達，并探討二者的臨床應用價值。方法收集該院人腦膠質瘤患者腦組織標本50例及腦創傷內減壓術中切除的腦組織標本20例，采用Western blot和免疫組織化學染色法測定腦組織中MMP-2和Bax的表達，并探討二者在膠質瘤中的相關性。結果MMP-2在膠質瘤腦組織中的表達高于正常腦組織(P<0.05)，在膠質瘤Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級中的陽性表達率分別為26.92%，70.83%(P<0.05)；Bax在腦膠質瘤中的表達量低于正常腦組織，但差異無統計學意義(P>0.05)，在膠質瘤Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級中的陽性表達率分別為76.95%、25.0%(P<0.05)。且人腦膠質瘤中MMP-2和Bax的表達呈負相關(r=-0.587，P<0.01)。結論Bax蛋白表達在腦膠質瘤發生發展中起著抑制作用，且與MMP-2蛋白呈負相關，二者聯合檢測可為膠質瘤的診斷提供判斷指標。

[關鍵詞]人腦膠質瘤；基質金屬蛋白酶；Bax

膠質瘤(glioma)是人顱內最常見的惡性腫瘤，占據顱腦腫瘤的35%～60%左右，呈侵襲性生長，其手術切除復發率高，預后差[1-2]。盡管隨著神經外科手術治療、基因治療、免疫治療及各種化療放療技術的發展，膠質瘤仍不能被完全治愈，其預后生存期不到1年[3]。膠質瘤細胞無限制的惡性增殖是導致機體惡病質的主要原因，而遷移、侵襲則是膠質瘤細胞發生遠處轉移的基礎，是引起病情惡化的主要因素，因此探討針對膠質瘤侵襲性生長相關蛋白在膠質瘤中的表達具有重要意義[4]。Bax是目前公認的參與細胞凋亡調控作用的最常見抑癌蛋白，是線粒體膜上的一種促凋亡蛋白，在多種腫瘤中低表達，且與多種腫瘤的發生發展密切相關，而與膠質瘤的關系報道較少[5]。同時金屬基質蛋白酶(MMP)通過對細胞外基質(ECM)的降解可促進癌細胞對周圍組織的浸潤，MMP-2能降解血管基底膜和細胞外基質中的Ⅳ型膠原成分，使腫瘤細胞突破結構屏障，與腫瘤內血管生成、侵襲、轉移相關。因此本研究應用Western blot和免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接染色法(SP)測定人腦膠質瘤腦組織中MMP-2和Bax的表達，探討二者與人腦膠質瘤惡性程度的相關性，為人腦膠質瘤的臨床治療和預后提供判斷指標。

1資料與方法

1.1材料收集本院外科手術切除的腦膠質瘤組織標本50例，其中男29例，女21例，平均年齡35歲，按WHO 2000年神經系統腫瘤分類標準，50例標本分為Ⅰ級11例，Ⅱ級15例，Ⅲ級9例，Ⅳ級15例。另取20例腦創傷內減壓術中切除的腦組織標本作為正常對照。腫瘤組織均經活組織病理診斷證實，均為單一腫瘤，無并發肝、腎疾病，均經醫院倫理委員會同意。

1.2主要試劑兔抗人MMP-2，Bax單克隆抗體購自Epitomics公司，SP法免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，ECL超敏發光試劑盒，BCA試劑盒，RIPA裂解液購自碧云天生物研究所。

1.3Western blot測定腦組織中MMP-2和Bax的表達RIPA裂解液裂解組織并收獲蛋白。根據BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳2～3 h，濕法轉膜30～50 min。一抗孵育，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min；二抗室溫孵育1～2 h。漂洗3次，每次5 min，滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用“Quantity One”軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

1.4免疫組織化學染色法測定腦組織中MMP-2和Bax的表達10%甲醛溶液固定組織，石蠟包埋，切片，抗原修復，室溫冷卻30 min，PBS沖洗2次，一抗室溫孵育，PBS沖洗2次，二抗(1∶100)37 ℃孵育，PS洗滌2次，DAB溶液顯色后沖洗、復染、脫水、透明、樹膠封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.5結果判斷MMP-2和Bax蛋白染色陽性主要定位于細胞質，采用半定量計分法判定，高倍鏡下隨機選擇10個視野，分別計算500個腫瘤細胞。切片中陽性細胞小于5%為0分，6%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，≥75%為4分；染色深度以無陽性細胞為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色或棕褐色為3分，免疫反應的總得分為陽性細胞百分率與免疫染色強度總得分的乘積。

1.6統計學處理采用SPSS17.0統計學軟件進行分析，Western blot結果采用t檢驗，免疫組織化學染色法結果采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1免疫組織化學染色檢測MMP-2和Bax在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中的表達MMP-2在正常腦組織中不表達，在人腦膠質瘤中陽性表達率為64.0%，差異具有統計學意義(P<0.01)；Bax在正常腦組織中及人腦膠質瘤中陽性表達率分別為60.0%及54.0%，差異不具有統計學意義(P>0.05)，見表1，圖1、圖2。

A：正常腦組織，B：腦膠質瘤腦組織。

圖1MMP-2在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中的表達(×200)

2.2Western blot檢測MMP-2和Bax在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中的表達MMP-2在正常腦組織中和腦膠質瘤腦組織中蛋白灰度值分別為(0.09±0.00)及(1.58±0.31)，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表2、圖3。Bax在正常腦組織中和腦膠質瘤腦組織中蛋白灰度值分別為(2.34±0.29)及(2.19±0.29)，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖4。

A：正常腦組織，B：腦膠質瘤腦組織。

圖2Bax在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中的表達(×200)

表1　MMP-2和Bax在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中的表達[n(%)]

**:P<0.01,與正常腦組織比較。

圖3　Western blot檢測MMP-2在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中的表達

圖4　Western blot檢測Bax在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中的表達

表2　MMP-2和Bax在腦膠質瘤腦組織和正常腦組織中表達的相對值

**：P<0.01，與正常腦組織比較。

2.3免疫組化檢測MMP-2和Bax在各種類型腦組織中的表達MMP-2在Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤中的陽性率分別為26.92%，70.83%；Bax在Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤中的陽性率分別為76.95%，25.0%，差異均具有統計學意義(P<0.01)，見圖5、圖6、表3。推測Bax在膠質瘤中起抑制作用，MMP-2在膠質瘤起促進作用。

A：Ⅰ～Ⅱ級腦膠質瘤組織，B：Ⅲ～Ⅳ腦膠質瘤組織。

圖5免疫組化檢測MMP-2在不同級別膠質瘤腦組織中的表達(×100)

2.4MMP-2和Bax表達的相關性經Pearson相關性分析，人腦膠質瘤腦組織中MMP-2和Bax表達呈負相關(r=-0.587，P<0.01)。

A：Ⅰ～Ⅱ級腦膠質瘤組織，B：Ⅲ～Ⅳ腦膠質瘤組織(×200)。

圖6免疫組化檢測Bax在不同級別膠質瘤腦組織中的表達

表3　免疫組化檢測MMP-2和Bax在各種類型腦組織中的表達[n(%)]

**：P<0.01，與Ⅰ～Ⅱ級腦膠質瘤組織比較。

3討論

膠質細胞瘤是起源于神經膠質細胞的腫瘤，是顱內最常見的惡性腫瘤。在膠質瘤的發生發展過程中，膠質瘤細胞的正常凋亡過程被抑制，導致膠質瘤細胞持續不斷地進行分裂與增殖。同時已有研究證實在腫瘤中檢測細胞凋亡相關基因的表達可成為腫瘤診斷和預后判斷的有效手段[6]。其中Bcl-2家族是被研究得最多的一類細胞凋亡相關基因。Bax是Bcl-2家族中促凋亡基因，當細胞內Bcl-2表達過多，與Bax形成二聚體，使膠質瘤細胞凋亡趨勢減弱，打破了細胞增殖與凋亡的平衡，使細胞數目不斷增加，從而表現出生長優勢，成為膠質瘤形成的重要基礎。因而探討Bax在膠質瘤中的表達具有重要意義，所以本試驗通過Western blot和免疫組化檢測發現Bax在人腦膠質瘤腦組織中表達低于正常組織，雖差異無統計學意義，但有一定趨勢。而與Bax在其他腫瘤中的低表達具有顯著性差異不同，可能是由于檢測的樣本不同，組織來源不同，樣本的年齡、性別差異有關。林英等[7]的研究顯示：在Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ級人膠質瘤中，Bax的表達陽性細胞率逐漸下降。本實驗也驗證了此觀點，但隨著病理分級的提高，其表達量也逐漸下降。說明隨著膠質瘤病理級別的升高，Bax表達量下降，Bax含量能一定程度上反映膠質瘤的惡性程度。同時進一步結合已報道文獻：在組織特異性啟動子和缺氧誘導元件的調控下Bax的過表達是針對膠質瘤的有效基因治療手段[8]。Tra-8 抗人DR2單抗聯合Bax過表達能顯著抑制體外膠質瘤細胞生長及體內U251細胞移植瘤的生長[9]。說明膠質瘤中Bax的過表達能顯著誘導膠質瘤凋亡。進一步腺病毒轉染Bax到D54 MG膠質瘤細胞中，發現聯合化療能顯著抑制膠質瘤細胞的增殖及克隆生長[10]。說明膠質瘤中Bax的過表達能提高化療的敏感性，進一步刺激膠質瘤細胞凋亡。從而說明Bax在膠質瘤中起抑制作用，當其過表達有可能可以提高化療的敏感性或直接抑制膠質瘤的增殖。

膠質瘤的侵襲性是膠質瘤遠處轉移的基礎，可以使膠質瘤邊界模糊，給手術帶來困難，是患者腫瘤復發，治療困難，預后欠佳的主要原因。在膠質瘤侵襲過程中，瘤細胞與細胞外基質表面受體結合后誘導宿主細胞產生MMPs，局部降解細胞外基質，腫瘤細胞通過缺失的細胞外基質向周圍組織浸潤，產生腫瘤的侵襲和轉移。其中MMP-2不僅可以降解細胞外基質中的明膠Ⅳ型膠原等，有利于膠質瘤細胞沿著受損的基底膜向周圍浸潤，還可以通過新生毛細血管促進膠質瘤的侵襲及轉移，是惡性膠質瘤浸潤和侵襲的標志。因而探討MMP-2在膠質瘤中的表達具有重要意義，所以本試驗通過Western blot和免疫組化檢測發現MMP-2在人腦膠質瘤中表達高于正常組織，與吳紅芳等[11]，Sun等[12]的研究結果一致，說明MMP-2與膠質瘤的發生有關。本文研究中亦發現Ⅲ～Ⅳ級人腦膠質瘤腦組織中MMP-2顯著高于Ⅰ～Ⅱ級，且其差異均有統計學意義，與陳廣等[13]，Kong等[14]的試驗結果一致：MMP-2蛋白及mRNA在Ⅲ～Ⅳ級中的表達高于Ⅰ～Ⅱ級，與膠質瘤的惡性程度及進展呈正相關。說明MMP-2跟人腦膠質瘤病理分級有一定關系。同時Kesanakurti等[15]的研究證實具有侵襲性的膠質瘤細胞分泌大量的MMP-2，其侵襲能力，膠質瘤惡性程度與MMP-2的表達量呈正相關。且有研究證實通過siRNA干擾MMP-2的表達，能顯著抑制膠質瘤細胞的侵襲能力[16]。從而說明MMP-2在膠質瘤的發生發展中起促進作用，并與膠質瘤的高侵襲能力密切相關，抑制MMP-2表達可能一定程度上遏制膠質瘤的侵襲程度。

同時在本研究中，經Pearson相關性分析，人膠質瘤腦組織中MMP-2和Bax表達負相關，結合已報道的Bax及MMP-2啟動子共轉染到人肝癌細胞SNU475中，可顯著促進癌細胞凋亡并抑制癌細胞侵襲[17]。推測出使Bax過表達及MMP-2低表達并轉染到體外膠質瘤細胞株中可一定程度上遏制膠質瘤的增殖及侵襲。

綜上所述，Bax在人腦膠質瘤中起抑制作用，MMP-2在人腦膠質瘤中起促進作用，二者都是判斷膠質瘤惡性程度，病理分級的有效指標，聯合檢測或靶向治療可一定程度上改善膠質瘤的惡性程度。

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doi:·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.023

作者簡介：楊立軍(1968-),學士，副主任醫師,主要從事顱內腫瘤研究。

[中圖分類號]R739.4

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)08-1074-04

(收稿日期：2015-09-30修回日期：2015-11-26)