濟(jì)川煎對(duì)“瀉劑結(jié)腸”大鼠的治療效果及作用機(jī)制研究

霍明東，張 波，陳玉根

210009 江蘇省南京市，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院肛腸科(霍明東，張波)；南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科(陳玉根)

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濟(jì)川煎對(duì)“瀉劑結(jié)腸”大鼠的治療效果及作用機(jī)制研究

霍明東，張 波，陳玉根

210009 江蘇省南京市，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院肛腸科(霍明東，張波)；南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科(陳玉根)

【摘要】目的了解濟(jì)川煎對(duì)“瀉劑結(jié)腸”大鼠的治療效果，并探討其作用機(jī)制。方法于2012年9月，選取健康成年無(wú)特定病原體(SPF級(jí))SD大鼠48只，36只經(jīng)大黃酸混懸液灌胃法制作大鼠“瀉劑結(jié)腸”動(dòng)物模型，然后隨機(jī)分為模型組、聚乙二醇組及濟(jì)川煎組各12只；余未經(jīng)造模處理的12只為對(duì)照組。對(duì)照組和模型組采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，聚乙二醇組采用聚乙二醇4000水溶液灌胃，濟(jì)川煎組采用濟(jì)川煎水煎液灌胃。檢測(cè)并比較4組大鼠的糞便干濕重比、首粒黑便排出時(shí)間，以及結(jié)腸組織酪氨酸激酶受體的干細(xì)胞因子受體(c-kit)和其配體干細(xì)胞因子(SCF)的mRNA、蛋白表達(dá)水平。結(jié)果濟(jì)川煎組大鼠的糞便干濕重比低于模型組、聚乙二醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聚乙二醇組大鼠的糞便干濕重比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。濟(jì)川煎組大鼠的首粒黑便排出時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，短于模型組和聚乙二醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聚乙二醇組大鼠的首粒黑便排出時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。濟(jì)川煎組大鼠c-kit、SCF的mRNA和蛋白表達(dá)水平高于模型組、聚乙二醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聚乙二醇組大鼠c-kit、SCF的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論濟(jì)川煎可提高“瀉劑結(jié)腸”大鼠的結(jié)腸動(dòng)力，軟化糞便，治療效果較好，其機(jī)制可能與修復(fù)SCF/c-kit信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】便秘；瀉劑結(jié)腸；濟(jì)川煎；治療結(jié)果

霍明東，張波，陳玉根.濟(jì)川煎對(duì)“瀉劑結(jié)腸”大鼠的治療效果及作用機(jī)制研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(13)：1598-1601.[www.chinagp.net]

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“瀉劑結(jié)腸”是慢傳輸型便秘的一種重要類(lèi)型，患者由于長(zhǎng)期服用刺激性瀉劑，導(dǎo)致結(jié)腸動(dòng)力進(jìn)行性減退，最終依賴(lài)瀉劑排便[1]。“瀉劑結(jié)腸”的臨床癥狀較為頑固，病情呈持續(xù)性進(jìn)展，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，但目前尚缺乏有效治療手段[2]。聚乙二醇是世界胃腸組織推薦的便秘治療藥物，中藥濟(jì)川煎也常被應(yīng)用于頑固性便秘的臨床治療，且臨床效果較好[3-5]，但目前關(guān)于其對(duì)“瀉劑結(jié)腸”治療效果的研究較少。本課題組在前期研究中，采用大黃酸混懸液灌胃法成功建立了“瀉劑結(jié)腸”大鼠模型[6]，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體的干細(xì)胞因子受體(c-kit)與其配體干細(xì)胞因子(SCF)在“瀉劑結(jié)腸”的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[7]。本研究旨在探討濟(jì)川煎對(duì)“瀉劑結(jié)腸”大鼠的治療效果，并探討其作用機(jī)制，以期為濟(jì)川煎的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于2012年9月，選取健康成年無(wú)特定病原體(SPF級(jí))SD大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2010-0004；合格證號(hào)：0023515〕。

1.2實(shí)驗(yàn)室藥品及設(shè)備濟(jì)川煎(肉蓯蓉20 g、當(dāng)歸30 g、牛膝10 g、澤瀉10 g、升麻10 g、枳殼20 g)水煎液，濃縮至60 ml，由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中藥房提供；大黃酸由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供；2%大黃酸混懸液：將大黃酸2 g加入100 ml 0.9%氯化鈉溶液中；聚乙二醇4000水溶液：將聚乙二醇4000 20 g加入60 ml蒸餾水中。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒由大連TAKARA公司提供；BCA蛋白定量試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配置試劑盒由北京碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；兔來(lái)源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、c-kit、SCF多克隆一抗和羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)二抗由美國(guó)Santa Cruz公司提供。

1.3方法48只大鼠中，36只經(jīng)大黃酸混懸液灌胃法制作大鼠“瀉劑結(jié)腸” 大鼠模型，然后隨機(jī)分為模型組、聚乙二醇組及濟(jì)川煎組各12只；余未經(jīng)造模處理的12只為對(duì)照組。

1.3.1建立“瀉劑結(jié)腸”大鼠模型采用大黃酸混懸液灌胃法，制作大鼠“瀉劑結(jié)腸”動(dòng)物模型。共經(jīng)歷3個(gè)循環(huán)，分別為：(1)隔日灌胃，1.2 ml·100 g-1·次-1；(2)灌胃5 d停2 d，1.2 ml·100 g-1·次-1；(3)灌胃5 d停2 d，1.6 ml·100 g-1·次-1。各循環(huán)均以80.0%大鼠稀便消失為結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)，造模時(shí)間共110 d。具體造模方法參照本課題組前期研究[6-7]。

1.3.2灌胃方法(1)模型組：以0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，連續(xù)30 d；(2)聚乙二醇組：以聚乙二醇4000水溶液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，連續(xù)30 d；(3)濟(jì)川煎組：以濟(jì)川煎水煎液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，連續(xù)30 d；(4)對(duì)照組：以0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃頻率及用量同模型組。

1.3.3糞便干濕重比和首粒黑便排出時(shí)間檢測(cè)停止灌胃后1周，收集大鼠2～4粒剛排出糞便，放入150 ℃烤箱中烘烤15 min，烘烤前、后均稱(chēng)取質(zhì)量，糞便干濕重比=烘烤后質(zhì)量/烘烤前質(zhì)量×100.0%；以10.0%活性炭懸液3 ml灌胃，記錄大鼠首粒黑便排出時(shí)間。

1.3.4結(jié)腸組織取材及c-kit和SCF的mRNA、蛋白水平檢測(cè)腹腔注射3.0%戊巴比妥鈉1 ml/kg，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉；切開(kāi)大鼠腹壁各層，取中段結(jié)腸組織4塊，置于-70 ℃冰箱中凍存。采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織c-kit和SCF的mRNA表達(dá)水平，采用蛋白印跡(Western blotting)法檢測(cè)結(jié)腸組織c-kit和SCF的蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參照，具體方法參照前期研究[7]。

2結(jié)果

2.14組大鼠糞便干濕重比和首粒黑便排出時(shí)間比較(1)4組大鼠糞便干濕重比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，濟(jì)川煎組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)4組大鼠首粒黑便排出時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，濟(jì)川煎組與對(duì)照組、模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

2.24組大鼠結(jié)腸組織c-kit、SCF的mRNA表達(dá)水平比較4組大鼠c-kit、SCF的mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，濟(jì)川煎組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2、圖1)。

2.34組大鼠結(jié)腸組織c-kit和SCF的蛋白表達(dá)水平4組大鼠c-kit、SCF的蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，濟(jì)川煎組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3、圖2)。

Table1Comparisonoffecesdry-wetratioandfirstblackstooltimeamongthefourgroups

組別例數(shù)糞便干濕重比(%)首粒黑便排出時(shí)間(min)對(duì)照組1243.1±3.1391.7±34.5模型組1252.2±4.2a489.9±26.9a聚乙二醇組1250.3±2.3a493.1±43.7a濟(jì)川煎組1242.2±2.7bc421.3±26.8abcF值26.87344.435P值<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聚乙二醇組比較，cP<0.05

Table2ComparisonofmRNAlevelsofc-kitandSCFincolontissueamongthefourgroups

組別例數(shù)c-kitmRNASCFmRNA對(duì)照組120.88±0.100.85±0.09模型組120.29±0.09a0.28±0.09a聚乙二醇組120.31±0.10a0.30±0.09a濟(jì)川煎組120.79±0.09bc0.76±0.09bcF值100.28188.917P值<0.001<0.001

注：c-kit=干細(xì)胞因子受體，SCF=干細(xì)胞因子；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聚乙二醇組比較，cP<0.05

注：c-kit=干細(xì)胞因子受體，SCF=干細(xì)胞因子，GAPDH=甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖14組大鼠結(jié)腸組織c-kit和SCF的mRNA表達(dá)

Figure 1The mRNA expression of c-kit and SCF in colon tissue among the four groups

Table3Comparisonofproteinlevelsofc-kitandSCFincolontissueamongthefourgroups

組別例數(shù)c-kit蛋白SCF蛋白對(duì)照組120.81±0.100.79±0.10模型組120.37±0.09a0.37±0.09a聚乙二醇組120.38±0.08a0.38±0.08a濟(jì)川煎組120.80±0.09bc0.79±0.09bcF值105.303105.638P值<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，aP>0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聚乙二醇組比較，cP<0.05

圖2　4組大鼠結(jié)腸組織c-kit和SCF的蛋白表達(dá)

Figure 2Protein expression of c-kit and SCF in colon tissue among the four groups

3討論

刺激性瀉劑的長(zhǎng)期服用和結(jié)腸動(dòng)力的進(jìn)行性下降是“瀉劑結(jié)腸”的重要特征。“瀉劑結(jié)腸”患者長(zhǎng)期服用番瀉葉、大黃等刺激性瀉劑，劑量隨使用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但結(jié)腸動(dòng)力卻呈進(jìn)行性下降，最終不得不依賴(lài)瀉劑排便。“瀉劑結(jié)腸”患者因過(guò)用苦寒藥物而伐傷陽(yáng)氣，寒涼傷陽(yáng)，瀉下傷朔，導(dǎo)致陰陽(yáng)兩虛，脾無(wú)力運(yùn)化，腎陽(yáng)不能溫煦，腎陰不能滋養(yǎng)，腸寒且燥，屬中醫(yī)脾腎兩虛、氣機(jī)淤滯證型。

濟(jì)川煎出自明代《景岳全書(shū)》，由肉蓯蓉、當(dāng)歸、牛膝、澤瀉、升麻、枳殼6種中藥組成，為溫陽(yáng)法治療便秘的常用方，在多種便秘的臨床治療中取得了較為滿意的療效[8-10]。但濟(jì)川煎對(duì)“瀉劑結(jié)腸”的治療效果如何，尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究用濟(jì)川煎治療“瀉劑結(jié)腸”大鼠30 d，結(jié)果顯示，與模型組相比，濟(jì)川煎組大鼠的首粒黑便排出時(shí)間縮短，糞便干濕重比降低，說(shuō)明濟(jì)川煎能夠提高“瀉劑結(jié)腸”大鼠的結(jié)腸動(dòng)力，軟化糞便，治療效果較好。

近期研究結(jié)果表明，Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)對(duì)胃腸動(dòng)力的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用[11-14]。ICC是一類(lèi)極其特殊的間質(zhì)細(xì)胞，介于腸神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌細(xì)胞之間，可調(diào)控腸神經(jīng)信號(hào)向效應(yīng)器平滑肌細(xì)胞的傳遞。ICC特異性表達(dá)酪氨酸激酶受體c-kit，c-kit與SCF組成的SCF/c-kit信號(hào)通路已被證實(shí)對(duì)ICC具有重要調(diào)控作用[15-18]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期

使用大黃酸可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸動(dòng)力減退，破壞大鼠正常SCF/c-kit信號(hào)通路[7]。本研究檢測(cè)了各組大鼠結(jié)腸組織c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與模型組相比，濟(jì)川煎組大鼠結(jié)腸組織中c-kit和SCF 的mRNA、蛋白表達(dá)水平較高，且與對(duì)照組比較無(wú)差異。說(shuō)明濟(jì)川煎的結(jié)腸動(dòng)力改善作用可能與其提高了c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達(dá)水平，修復(fù)SCF/c-kit信號(hào)通路有關(guān)。另外，濟(jì)川煎組大鼠的糞便干濕重比與對(duì)照組比較無(wú)差異，但首粒黑便排出時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，說(shuō)明濟(jì)川煎組大鼠的結(jié)腸動(dòng)力與正常水平還存在差距。其可能原因?yàn)椋?1)濟(jì)川煎的治療時(shí)間未達(dá)到結(jié)腸組織中ICC的數(shù)量及表型轉(zhuǎn)化恢復(fù)所需時(shí)間；(2)“瀉劑結(jié)腸”發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，除SCF/c-kit信號(hào)通路外，尚存在其他因素參與。

本研究結(jié)果還顯示，聚乙二醇組與模型組相比，糞便干濕重比和首粒黑便排出時(shí)間均無(wú)差異，說(shuō)明聚乙二醇雖然可以保留大鼠腸道內(nèi)的水分，軟化糞便，但其不能有效提高大鼠的結(jié)腸動(dòng)力。聚乙二醇組大鼠c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達(dá)水平與模型組比較也無(wú)差異，說(shuō)明其在治療過(guò)程中無(wú)法修復(fù)異常的SCF/c-kit信號(hào)通路。

綜上所述，濟(jì)川煎可以提高“瀉劑結(jié)腸”大鼠的結(jié)腸動(dòng)力，軟化糞便，治療效果較好。其機(jī)制可能與提高結(jié)腸組織中c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達(dá)水平，修復(fù)SCF/c-kit信號(hào)通路有關(guān)。但“瀉劑結(jié)腸”的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，是否存在其他影響因素尚有待進(jìn)一步研究，濟(jì)川煎對(duì)“瀉劑結(jié)腸”的治療效果也有待大規(guī)模的臨床研究來(lái)證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：霍明東進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；張波進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；陳玉根進(jìn)行質(zhì)量控制與審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：王鳳微)

Therapeutic Effect of Jichuan Decoction on Rats With Cathartic Colon and Its Mechanism

HUOMing-dong,ZHANGBo,CHENYu-gen.

DepartmentofAnorectalDiseases,ZhongdaHospitalSoutheastUniversity,Nanjing210009,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of jichuan decoction on rats with cathartic colon and its mechanism.MethodsIn September 2012,48 healthy adult SPF SD rats without specific pathogen free were selected,and 36 model rats with cathartic colon were made by gavage of parietic acid injectable suspension.The 36 model rats were assigned into model group,polyethylene glycol group and jichuan decoction group,with 12 rats in each group;the rest 12 rats that were not built into models were assigned into control group.Control group and model group were administrated with 0.9% sodium chloride solution by gavage;polyethylene glycol group was administrated with polyethylene glycol 4000 water solution by gavage;jichuan decoction group was administrated with water decoction of Jichuan.The feces dry-wet ratio,first black stool time,and the mRNA and protein expression level of colon tissue c-kit and SCF of the four groups were detected and compared.ResultsJichuan decoction group was lower than model group and polyethylene glycol group in feces dry-wet ratio(P<0.05),but was not significantly different from control group(P>0.05).Polyethylene glycol group was higher than control group in feces dry-wet ratio(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).Jichuan decoction group was longer than control group in first black stool time,but was shorter than model group and polyethylene glycol group(P<0.05).Polyethylene glycol group was longer than control group in first black stool time(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).Jichuan decoction group was higher than model group and polyethylene glycol group in the mRNA and protein levels of c-kit and SCF(P<0.05),but was not significantly different from control group(P>0.05).Polyethylene glycol group was lower than control group in the mRNA and protein levels of c-kit and SCF(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).ConclusionJichuan decoction can improve the colonic motility of rats with cathartic colon and make their feces soften.Its efficacy is favorable,and the mechanism may be related with repairing the signal path of SCF/c-kit.

【Key words】Constipation;Cathartic colon;Jichuan decoction;Treatment outcome

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373645)；江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(LZ13242、PY201517)

通信作者：張波，210009 江蘇省南京市，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院肛腸科；E-mail：13400057505@163.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 442.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.13.028

(收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-03-16)

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·