通心絡聯合外周血間充質干細胞移植對糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路的影響研究

郭勇英，位 庚，李紅蓉，田 超，張軍芳，高懷林

050000 河北省石家莊市，河北省中醫院醫務處(郭勇英)；河北省絡病重點實驗室(郭勇英，位庚，李紅蓉)；河北醫科大學研究生學院(位庚，李紅蓉)；河北以嶺醫藥研究院(田超，張軍芳)；河北醫科大學附屬以嶺醫院內分泌科，河北省中醫藥絡病理論指導糖尿病足防治重點研究室(高懷林)

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通心絡聯合外周血間充質干細胞移植對糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路的影響研究

郭勇英，位 庚，李紅蓉，田 超，張軍芳，高懷林

050000 河北省石家莊市，河北省中醫院醫務處(郭勇英)；河北省絡病重點實驗室(郭勇英，位庚，李紅蓉)；河北醫科大學研究生學院(位庚，李紅蓉)；河北以嶺醫藥研究院(田超，張軍芳)；河北醫科大學附屬以嶺醫院內分泌科，河北省中醫藥絡病理論指導糖尿病足防治重點研究室(高懷林)

【摘要】目的探討通心絡聯合外周血間充質干細胞移植對糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的影響。 方法于2014年3月，選取無特定病原體(SPF級)雄性SD大鼠70只，10只為對照組；60只制作糖尿病足大鼠模型，然后隨機分為模型組、西洛他唑組、通心絡組、外周血間充質干細胞移植組、西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組、通心絡+外周血間充質干細胞移植組各10只。完成相應實驗操作28 d后，檢測并比較各組大鼠的外周血間充質干細胞及缺血下肢肌組織中的內皮糖蛋白(CD)105、細胞周期蛋白(cyclinD1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)表達水平。結果通心絡+外周血間充質干細胞移植組大鼠的干細胞數、積分光密度高于外周血間充質干細胞移植組、西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組，差異有統計學意義(P<0.05)；西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組大鼠的干細胞數、積分光密度高于外周血間充質干細胞移植組，差異有統計學意義(P<0.05)。6個造模組大鼠缺血下肢肌組織中CD105、cyclinD1、p-Akt表達水平低于對照組，p-GSK-3β表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；5個用藥組大鼠缺血下肢肌組織中CD105、cyclinD1、p-Akt表達水平高于模型組，p-GSK-3β表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；通心絡+外周血間充質干細胞移植組大鼠缺血下肢肌組織中CD105、cyclinD1、p-Akt表達水平高于西洛他唑組、通心絡組、外周血間充質干細胞移植組，p-GSK-3β表達水平低于西洛他唑組、通心絡組、外周血間充質干細胞移植組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論通心絡聯合外周血間充質干細胞移植可以通過調節PI3K/Akt信號通路，促進內皮細胞增殖、分化，從而促進糖尿病足大鼠的新生血管形成。

【關鍵詞】糖尿病足；通心絡；間質干細胞移植；血管生成

郭勇英，位庚，李紅蓉，等.通心絡聯合外周血間充質干細胞移植對糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路的影響研究[J].中國全科醫學，2016，19(13)：1602-1606.[www.chinagp.net]

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糖尿病足(DF)是糖尿病的嚴重并發癥之一，關鍵治療環節為促進缺血狀態下治療性血管新生和有效側支循環建立，進而改善缺血狀態[1]。血管新生是一個較為復雜的過程，可分為早、晚期兩個階段。早期包括血管內皮細胞(VEC)的前體細胞分化、增殖、遷移，融合成初期血管網絡；晚期包括血管芽生、分支，形成小血管，血管支持細胞(如平滑肌細胞)分泌、充實在新生血管周圍，進而在原有血管基礎上形成新的成熟血管[2-3]。本課題組前期研究結果表明，外周血間充質干細胞移植，可以增加糖尿病足大鼠缺血下肢的血流灌注量，促進側支循環建立[4]。而通心絡可以改善糖尿病足大鼠的心肌梗死區微環境，增加干細胞移植后存活率[5]，促進血管內皮生長因子(VEGF)表達，增加新生血管和側支循環建立[6]，增加缺血下肢的血流灌注量[4]。本研究旨在探討通心絡聯合外周血間充質干細胞移植對糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的影響，以探討其涉及的分子機制，為糖尿病并發癥的臨床治療提供依據。

1材料與方法

1.1實驗動物于2014年3月，選取無特定病原體(SPF級)雄性SD大鼠70只，4周齡，體質量190～230 g，由中國食品藥品檢定研究院提供〔實驗動物許可證號：SCX K(京)2009-0017；合格證號：11400500002012〕；另選取清潔級雄性SD大鼠10只，15周齡，體質量300 g左右，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供〔實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001；合格證號：11400700026920〕。

1.2實驗室藥品及設備(1)藥品：通心絡原粉(人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成)，由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供(生產批號：20120924)；西洛他唑片，由浙江大冢制藥有限公司提供(生產批號：130801P)。藥品配制和保存方法見本課題組前期研究[4]。(2)試劑：鏈脲佐菌素(STZ)由美國Amresco公司提供(生產批號：1262C443)，重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)由深圳新鵬生物工程有限公司提供(生產批號：201302009)，細胞處理試劑盒和4、6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)由河北博海生物工程開發有限公司提供(生產批號：20140428、20130808)，內皮糖蛋白(CD)90、CD105、CD49A、CD49B、CD49C、CD29、CD104及CD105-熒光素(FITC)、CD44-FITC、CD34-FITC由德國美天旎公司提供(生產批號：30.APR.2013)，CD105單克隆抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗嗎啡多克隆抗體IgG、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)抗嗎啡多克隆抗體IgG、細胞周期蛋白(cyclinD1)兔單克隆抗體均由美國Abcam公司提供(生產批號：ab137875、ab5626、ab75745、ab137875)。(3)設備和器材：AL204精密分析天平由瑞士梅特勒-托利多公司提供，CTR6000熒光顯微鏡、CM1950型切片機由德國Leica公司提供，干細胞磁性分選架、分選器、分選柱由德國美天旎公司提供，170-930型電轉膜儀、170-3940型半干轉膜儀、165-8001型垂直電泳儀由美國Bio-Rad公司提供。

1.3方法70只SPF級雄性SD大鼠中，10只為對照組；60只制作糖尿病足大鼠模型，然后隨機分為模型組、西洛他唑組、通心絡組、外周血間充質干細胞移植組、西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組、通心絡+外周血間充質干細胞移植組各10只。

1.3.1模型方法參考文獻[5-6]，高脂喂養大鼠8周，熱量配比為脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白質20.1%；禁食16 h后，造模組以35 mg/kg腹腔注射STZ，對照組注入同體積枸櫞酸鈉緩沖溶液；以72 h后尾尖血糖>16.7 mmol/L為造模成功。

1.3.2灌胃方法通心絡組、通心絡+外周血間充質干細胞移植組大鼠以通心絡(0.4 g/kg，1 次/d)灌胃，西洛他唑組、西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組大鼠以西洛他唑(18 mg/kg，1 次/d)灌胃，對照組、模型組、外周血間充質干細胞移植組大鼠以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3.3手術方法(1)同源異體供體大鼠的外周血間充質干細胞分離方法見課題組前期研究[4]。(2)腹腔注射10.0%水合氯醛進行麻醉；將大鼠仰臥固定，備皮消毒；縱行切開右側腹股溝正中皮膚，分離腹股溝下股動、靜脈，結扎并剪斷；創口處局部涂撒青霉素，并進行皮膚縫合。(3)術后3 d，外周血間充質干細胞移植組、西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組、通心絡+外周血間充質干細胞移植組大鼠，沿股動脈多點肌肉注射進行干細胞移植(1.0×106/ml)，對照組、模型組、通心絡組、西洛他唑組大鼠，同點肌肉注射等體積無菌洛斯維(RPMI)-1640培養基。

1.4檢測指標及方法

1.4.1外周血間充質干細胞檢測術后28 d，取干細胞移植治療大鼠的肌中段，避光情況下行冷凍切片，厚度為12 μm；室溫下干燥1 h，以紫外光激發下干細胞細胞核發出藍色熒光為DAPI標記成功(見圖1)。由實驗室人員采用Image-Pro Plus5.0(IPP)圖像處理分析軟件，計算各組大鼠的干細胞數、熒光強度B、積分光密度[7]。

注：DAPI=4、6-聯脒-2-苯基吲哚

圖1外周血間充質干細胞的DAPI標記

Figure 1DAPI marking of PB-MSCs

1.4.2CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表達水平檢測將大鼠缺血下肢肌組織加入組織裂解液，勻漿；4 ℃下，以8 000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，分離上清液。取各組蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，具體操作方法參照課題組前期研究[4]。蛋白印跡(Western blotting)法檢測各組大鼠的CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表達水平，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照。

2結果

2.13組大鼠外周血間充質干細胞檢測結果比較3組進行了外周血間充質干細胞移植大鼠的干細胞數、積分光密度比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，通心絡+外周血間充質干細胞移植組與外周血間充質干細胞移植組、西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組與外周血間充質干細胞移植組比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.27組大鼠缺血下肢肌組織中CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表達水平比較7組大鼠缺血下肢肌組織中CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，6個造模組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組與5個用藥組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；通心絡+外周血間充質干細胞移植組與西洛他唑組、通心絡組、外周血間充質干細胞移植組比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表2、圖2)。

Table1ComparisonofthedetectionresultsofPB-MSCsamongthethreegroups

組別例數干細胞數(×106/L)熒光強度B積分光密度外周血間充質干細胞移植組1016±4298±3西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組1021±4a2116±6a通心絡+外周血間充質干細胞移植組1027±4ab2135±4abF值18.96-168.36P值<0.01-<0.01

注：-代表無此數據；與外周血間充質干細胞移植組比較，aP<0.05；與西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組比較，bP<0.05

Table2ComparisonoftheexpressionlevelsofCD105,cyclinD1,p-Aktandp-GSK-3βinischemiclowerlimbmuscletissueamongthesevengroups

組別例數CD105cyclinD1p-Aktp-GSK-3β對照組100.58±0.031.23±0.051.14±0.040.19±0.04模型組100.08±0.02a0.36±0.01a0.17±0.02a1.12±0.11a西洛他唑組100.32±0.07ab0.47±0.03ab0.67±0.04ab0.68±0.01ab通心絡組100.33±0.03ab0.55±0.09abc0.71±0.03ab0.70±0.05ab外周血間充質干細胞移植組100.41±0.01abcd0.63±0.02abcd0.82±0.02abcd0.63±0.06abd西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組100.48±0.02abcde0.89±0.04abcde0.96±0.08abcde0.53±0.01abcde通心絡+外周血間充質干細胞移植組100.49±0.02abcde0.93±0.03abcde1.02±0.05abcde0.49±0.03abcdeF值231.83452.30515.85262.36P值<0.01<0.01<0.01<0.01

注：CD105=內皮糖蛋白105，cyclinD1=細胞周期蛋白，p-Akt=磷酸化蛋白激酶B，p-GSK-3β=磷酸化糖原合成酶激酶-3β；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西洛他唑組比較，cP<0.05；與通心絡組比較，dP<0.05；與外周血間充質干細胞移植組比較，eP<0.05

注：A=對照組，B=模型組，C=通心絡組，D=西洛他唑組，E=外周血間充質干細胞移植組，F=通心絡+外周血間充質干細胞移植組，G=西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組；CD105=內皮糖蛋白105，cyclinD1=細胞周期蛋白，p-GSK-3β=磷酸化糖原合成酶激酶-3β，p-Akt=磷酸化蛋白激酶B，GAPDH=甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖27組大鼠缺血下肢肌組織中CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表達

Figure 2Expression of CD105,cyclinD1,p-Akt and p-GSK-3β in ischemic lower limb muscle tissue among the seven groups

3討論

糖尿病患者存在長期的糖脂代謝紊亂和氧化應激引起的內皮功能損害，導致其血管功能障礙，從而引發動脈粥樣硬化，血管壁彈性減弱、管腔阻塞或狹窄，累及下肢遠端動脈，最終導致肢體遠端血液循環障礙，肢端缺血低氧，形成糖尿病足，嚴重者甚至可能會出現潰爛、壞疽[8-9]。長期的高血糖狀態不僅會導致血管病變，發生嚴重缺血事件，也會嚴重損傷側支血管的形成能力[10]。因此，糖尿病足的臨床治療關鍵為促進缺血狀態下的血管新生和側支循環形成。

目前，臨床上常用的糖尿病足治療方法有藥物治療、外科手術治療及血管腔內治療，但目前尚缺乏對遠端流出道嚴重狹窄患者的有效治療方法。西洛他唑具有明顯的抗血小板聚集和擴張血管作用，可以防止血栓形成和血管閉塞，臨床上常被應用于糖尿病足患者的微循環改善治療。干細胞是一類具有自我復制和多向分化潛能的細胞，能產生表現型和基因型與本身完全相同的子細胞。隨著干細胞移植技術在再生醫學領域的發展，外周血間充質干細胞移植逐漸成為糖尿病足患者的臨床治療新方法。根據干細胞可以分化為血管內皮細胞、形成新生血管的原理，可以將外周血間充質干細胞分離出來，移植到患者的缺血下肢，使其逐漸分化形成新生血管，建立側支循環，從而改善和恢復缺血下肢血流，達到治療糖尿病足的目的。

中醫學認為，消渴日久，氣陰兩虛，脈絡瘀阻，血行不暢，肢端失養，久病入絡，可誘發消渴脫疽。脈絡學說對血管病變的防、治均有重要的指導作用，其根據中醫脈與血管、脈的分支脈絡與中小血管、脈絡末端的孫絡與微血管、微循環在解剖形態學和生理功能方面的高度相關性，提出了“脈絡-血管系統病”概念[11]。糖尿病足是糖尿病日久累及肢體大、中、小、微血管的一類并發癥，屬中醫“消渴脫疽”范疇，故糖尿病足亦屬于“脈絡-血管系統病”研究范疇。在以脈絡“不通”為實質的共性發病機制中，依據“絡以通為用”的治療總則，而通心絡是通絡藥物的代表方藥。既往研究結果表明，通心絡具有促進雞胚絨毛尿囊膜(CAM)和腦缺血后血管新生的作用[12-13]。

血管新生指內皮細胞在原有血管的基礎上，出現增殖、遷移、重塑，從而形成新血管的過程[14]。常用標志物包括CD34、CD31、CD105、CD146等。CD105可以調節內皮-間質的信號傳遞，參與血管生成過程，與泛內皮細胞標志物(如CD31、CD34相關抗原)不同的是，CD105僅在處于增殖狀態的血管內皮細胞中高表達，而在正常組織的血管內皮細胞中無或僅有微弱表達[15-17]，故其可作為新生血管的重要標志物。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肌組織中的CD105表達明顯降低，說明糖尿病足大鼠的新生血管受到抑制，新生血管數量不足。在血管堵塞不易開通的情況下，側支循環數量減少，新生血管數量不足，血供減少是糖尿病足患者創口不易愈合的重要原因。本研究中，與模型組相比，各用藥組大鼠肌組織中的CD105表達水平均升高，且通心絡+外周血間充質干細胞移植組大鼠肌組織中的CD105水平高于通心絡組、西洛他唑組及外周血間充質干細胞移植組。術后28 d，通心絡+外周血間充質干細胞移植組大鼠的干細胞數和積分光密度優于外周血間充質干細胞移植組和西洛他唑+外周血間充質干細胞移植組，說明通心絡聯合干細胞移植治療可以增加糖尿病足大鼠的新生血管數量，改善血供情況。

PI3K/Akt信號通路的激活主要發揮抗凋亡、促進內皮細胞增殖、遷移的保護作用，既往研究結果表明，激活的PI3K/Akt信號通路可能在干細胞生長、存活及增殖中扮演重要角色[18-21]。本研究中，與對照組比較，模型組大鼠肌組織中的p-GSK-3β水平較高，p-Akt、cyclinD1水平較低；與模型組比較，各用藥組大鼠肌組織中的p-GSK-3β表達水平降低，p-Akt、cyclinD1表達水平升高，且通心絡+外周血間充質干細胞移植組大鼠肌組織中p-GSK-3β表達水平較低，cyclinD1、p-Akt表達水平較高。提示通心絡聯合外周血間充質干細胞移植具有促進糖尿病足大鼠血管新生的作用，其可能是通過激活PI3K/Akt信號通路，上調p-Akt、抑制p-GSK-3β表達，進而上調cyclinD1表達，來促進血管內皮細胞增殖、遷移以及局部缺血區新生血管形成的。

作者貢獻：郭勇英進行實驗設計與實施、撰寫論文、成文并對文章負責；位庚、李紅蓉、田超進行實驗實施；張軍芳進行實驗評估、資料收集；高懷林進行質量控制與審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：王鳳微)

Influence of Tongxinluo Combined With Peripheral Blood Derived Mesenchymal Stem Cells Transplantation on the Angiogenesis Through PI3K/Akt Signal Pathway of Diabetic Foot Rats

GUOYong-ying,WEIGeng,LIHong-rong,etal.

MedicalDepartment,HospitalofTraditionalChineseMedicineofHebeiProvince,Shijiazhuang050000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence of tongxinluo(TXL) combined with peripheral blood derived mesenchymal stem cells(PB-MSCs) transplantation on the angiogenesis through PI3K/Akt signal pathway of diabetic foot rats.MethodsIn March 2014,we selected 70 SPF male SD rats,and assigned 10 rats into control group and built the rest 60 rats into diabetic foot rat models.Then the model rats were randomly divided into 6 groups:model group,cilostazol group,TXL group,PB-MSCs group,TXL combined PB-MSCs(T-MSCs) group and cilostazol combined PB-MSCs(C-MSCs) group,with 10 rats in each group.28 days after the completion of corresponding operation,PB-MSCs and the expression levels of CD105,cyclinD1,p-Akt and p-GSK-3β and in ischemic lower limb muscle tissue were detected and compared.ResultsT-MSCs group was higher than PB-MSCs group and C-MSCs group in the number of PB-MSCs and integral optical density(P<0.05);C-MSCs group was higher than PB-MSCs group in the number of PB-MSCs and integral optical density(P<0.05).The 6 model groups were lower than control group in the expression levels of CD105,cyclinD1,p-Akt,and were higher than control group in the expression level of p-GSK-3β(P<0.05);the 5 groups that were administrated with drugs were higher than model group in the expression levels of CD105,cyclinD1 and p-Akt,but were lower than model group in the expression level of p-GSK-3β(P<0.05);T-MSCs group was higher than cilostazol group,TXL group and PB-MSCs group in the expression levels of CD105,cyclinD1 and p-Akt,and was lower than cilostazol group,TXL group and PB-MSCs group in the expression of p-GSK-3β(P<0.05).ConclusionTXL combined with PB-MSCs transplantation may promote the endothelial cell proliferation and differentiation by regulating PI3K/Akt signaling pathway,thus facilitating the angiogenesis of diabetic foot rats.

【Key words】Diabetic foot;Tongxinluo;Mesenchymal stem cell transplantation;Angiogenesis

基金項目：國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2011AA020115)；國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2012CB518606)；河北省中醫藥管理局科研計劃項目(2014082)

通信作者：高懷林，050000 河北省石家莊市，河北醫科大學附屬以嶺醫院內分泌科，河北省中醫藥絡病理論指導糖尿病足防治重點研究室；E-mail：gaohuailin@126.com

【中圖分類號】R 587.29

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.13.029

(收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-03-24)

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