植物染色體制片方法的改進

肖春林（兵團第六師農業科學研究所，新疆　五家渠　831300）

植物染色體制片方法的改進

肖春林
（兵團第六師農業科學研究所，新疆五家渠831300）

摘要：以普通小麥（2n = 6x = 42）為材料，對其種子進行發根，取其根尖分生區進行酶解法染色體制片。對比常規壓片和去壁低滲火焰干燥法制片技術，酶解法制片技術易獲得更好的分裂相，分布更加均勻的染色體片，更有利于后期的原位雜交進行信號標記實驗。

關鍵詞：小麥；根尖分生區；染色體制片

植物染色體制片技術是植物細胞遺傳學、染色體工程、植物細胞生物學、植物細胞分類學和物種生物學等眾多學科的基本實驗技術[1]。對于染色體形態、結構、遺傳行為及細胞變異等遺傳學現象的分析，可以大大提高作物育種工作的效率和質量。因此，改善并提高染色體制片技術顯得尤為重要。目前常用的染色體制片技術有2種，即普通壓片技術和去壁低滲火焰干燥技術。前者雖然操作簡單實用，但是需要制片者取材時間適宜，壓片力量適中，對操作者的熟練程度要求較高；且處理一些細胞壁堅硬、難以軟化的材料時，也不易獲得良好的制片[2-3]。后者相比前者，需要的制片經驗較少，且制片效果較好，但操作過程涉及酒精燈，需要火焰干燥和蓋玻片壓片，對染色體造成部分影響。酶解法在兩者技術的基礎上，對部分實驗操作進行了改善，不僅可以得到分散良好的有絲分裂中期分裂相，而且還縮短了酶解的時間,提高了制片的效率，從而獲得更好的染色體制片，為細胞學觀察及相關的原位雜交（GISH）實驗做準備。

1　材料與方法

1.1材料來源

市場購買的普通小麥種子。

1.2材料制備

1.2.1冷處理

將普通小麥種子置于裝有濕潤濾紙的培養皿內，小麥腹溝朝下貼在濾紙上，于4℃冰箱冷處理24h。

1.2.2發根、剪根

冷處理的種子放入25℃培養箱中培養24 h以上，待根尖長至2～3 cm時剪下。

1.2.3預處理

濕潤根尖裝于2mLEP管中，笑氣處理2h左右。

1.2.4固定、保存

預處理的根尖用90%冰醋酸浸泡3～5 min后轉入70%酒精中，4℃冰箱保存。

1.2.5清洗

用鑷子取出固定根尖，蒸餾水反復漂洗3次，清洗干凈后用絲巾擦盡根尖水珠。

1.2.6配制酶液

將提前配好的纖維素酶0.02 g與果膠酶0.01 g溶于1 mL檸檬酸鈉緩沖液（滅菌）中，每20 μL分裝于EP管中。

1.2.7酶解

剪取根尖分生區（乳白色）2mm左右，紙巾擦干其上水分，置于20 μL酶液EP管中，37℃水浴1h左右。

1.2.8漂洗、脫水

吸干EP管中酶液，加入50 μL蒸餾水，反復漂洗3次；吸盡EP管中蒸餾水，加100%C2H5OH脫水2次。

1.2.9滴片、照相

每一根尖加20 μL冰醋酸，用20 μL白色槍頭搗碎根尖1 min，吸取10 μL溶液滴于載玻片上，加蓋玻片，相差顯微鏡下觀察照相。

1.3.0永久封片

液氮冷凍后用刀片將蓋玻片和載玻片分離，分別干燥后用“指甲油”進行封片處理。

2　結果與討論

按照酶解法制得的小麥根尖染色體片（未染色）如圖1，染色體形態比清晰，且分布比較均勻，都為42條。但需要注意的是，用此方法制片若纖維素酶與果膠酶的比例濃度不夠，在顯微鏡下觀察時，會出現染色體重疊、分散不均勻或細胞壁及細胞質仍存在的現象，影響染色體的觀察。

圖1　普通小麥根尖分生區染色體圖（2n = 6x = 42）

相比常規染色體制片方法，酶解法優點在于：（1）預處理中（笑氣處理）相比傳統的冰水混合物需處理24 h以上，該方法僅為2 h左右，大大縮短了處理時間；（2）對常規壓片法中碰到細胞壁等堅硬無法軟化的材料，酶解法利用纖維素酶和果膠酶可以溶解細胞壁、部分細胞質及兩者之間的果膠物質，充分軟化分散細胞，使染色體分布均勻；（3）避免了常規制片法中的手指壓片及解剖針敲擊來分散染色體并使之處于同一平面上的操作經驗和力度問題；（4）整個操作過程中僅酶液濃度的酶解時間需要精確掌控，其他操作較規范，易把握。

參考文獻

[1]李懋學，張贊平.作物染色體及其研究技術[M].北京:中國農業出版社，1996：63-66.

[2]王幼平.植物染色體制片方法的改進[J].生物學通報，2007，42 （10）：55.

[3]蒿若超，武美燕.一種植物染色體制片改良方法[J].長江大學學報：自然科學版，2011，8（2）：236-238.

收稿日期：2016—01—11