靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒的構建與鑒定>*

何玉婷，李　娟，孫冉冉，陳曉龍，申　珅，闞全程，余祖江#

1)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 450052　2)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052

靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒的構建與鑒定>*

何玉婷1)，李娟1)，孫冉冉1)，陳曉龍1)，申珅1)，闞全程2)，余祖江1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 4500522)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052

關鍵詞HIF-1α；CRISPR/Cas9；肝細胞癌；載體構建；基因敲除

摘要目的：構建靶向低氧誘導因子(HIF)-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒，并體外鑒定其敲除效果。方法：設計靶向HIF-1α基因的gRNA序列，將其插入到CRISPR/Cas9質粒骨架載體pCAG-T7中，轉化后挑取克隆，進行測序驗證。將構建好的重組質粒體外轉染人肝癌細胞HepG2和SK-Hep-1，利用嘌呤霉素進行篩選并擴大培養獲得HIF-1α基因敲除混合克隆細胞，應用Western blot技術檢測未轉染細胞和混合克隆細胞中HIF-1α蛋白的表達情況。結果：經測序驗證，成功構建了靶向HIF-1α的重組質粒pCAG-T7-HIF-1α-gRNA，經Western blot驗證，轉染該重組質粒后人肝癌細胞株HepG2和SK-Hep-1經CoCl2誘導HIF-1α蛋白表達明顯減弱。結論：成功構建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒載體。

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是指肝細胞或肝內膽管細胞發生的惡性腫瘤，惡性程度高、進展迅速、預后差，是我國常見的惡性腫瘤之一，且發病率有逐年增高趨勢[1]。因此，尋找新型的、有效的輔助治療手段對提高HCC的總體生存率顯得尤為重要[2]。低氧誘導因子(hypoxia induced factor,HIF)-1在缺氧條件下能激活多種缺氧反應性基因的表達, 是目前發現的惟一在特異性低氧狀態下發揮活性的轉錄因子[3]。研究[4-5]表明，在前列腺癌、胰腺癌、腦瘤以及肝癌等多種腫瘤中均存在HIF-1α過表達,而在相應正常組織中無表達,提示HIF-1α的表達與腫瘤明顯相關，HIF-1α通過調控下游基因的表達，參與并影響腫瘤細胞的重要生物學行為。相關研究[6]證實，HIF-1α表達水平與肝癌的發生發展具有密切關系，所以靶向HIF-1α的基因治療策略可能成為HCC治療的新的手段。

近年來興起的CRISPR/Cas9技術具有強大的基因改造能力并且操作便捷，能夠在體內外實現精確的基因編輯，其在基因編輯領域的應用日漸廣泛[7]。因此，作者構建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9質粒載體，并利用其敲除人肝癌細胞中的HIF-1α基因，為進一步探索和證實HIF-1α與肝癌發生發展及預后之間的關系打下了基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑大腸桿菌DH5α感受態購自北京康為世紀生物科技有限公司，CRISPR/Cas9質粒骨架pCAG-T7購自北京唯尚立德公司，質粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司，轉染試劑Easyfect購自無錫藥科美生物科技有限公司。HIF-1α抗體購自美國Novus公司，氯化鈷及其余化學試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2靶向HIF-1α基因的gRNA的設計和合成根據CRISPR/Cas9靶點設計原則，首先應用在線工具(http://crispr.mit.edu)設計出符合實驗要求的gRNA，對其進行篩選及脫靶效應評估，挑選出特性強的gRNA。gRNA設計的主要原則[8]：3’端要有NGG堿基序列的20個連續的堿基序列，且不包括PAM序列；必須在外顯子區域且選擇靠前的外顯子，以提高移碼突變的概率；然后利用生物信息學軟件進行全基因組比對，避免選擇脫靶風險大的靶點序列，需考慮到gRNA效率以及染色體和核小體三維結構可能造成的空間位阻效應所致的Cas9無法結合的情況。同時選擇出以下3個序列作為靶點序列(圖1和表1)并進行體外篩選，以增加成功率和敲除效率。引物由上海生工生物工程有限公司合成。將3對gRNA引物稀釋待用。

圖1　靶向HIF-1α基因靶點位置示意圖

引物名稱引物序列(5-3)HIF-1α-gRNA-1-FAAACACCGTGCGTGTGAGGAAACTTCHIF-1α-gRNA-1-RCTCTAAAACGAAGTTTCCTCACACGCAHIF-1α-gRNA-2-FAAACACCGAACATAAAGTCTGCAACAHIF-1α-gRNA-2-RCTCTAAAACTGTTGCAGACTTTATGTTHIF-1α-gRNA-3-FAAACACCGTCCTCAGTCGACACAGCCHIF-1α-gRNA-3-RCTCTAAAACGGCTGTGTCGACTGAGGA

1.3pCAG-T7-HIF-1α-gRNA載體的構建及鑒定

質粒構建過程示意圖見圖2。PCR反應體系：10 μmol/L HIF-1α-gRNA-F、gRNA-R各1 μL，solutionⅠ5 μL，用ddH2O 稀釋至10 μL。95 ℃反應3 min，95 ℃緩慢自然冷卻至25 ℃，16 ℃反應5 min。然后將退火產物連接到載體中：pCAG-T7 1 μL，PCR反應產物2 μL，用ddH2O 稀釋至10 μL，充分混合后，室溫(25 ℃)靜置 5 min。取連接產物5 μL加入到剛解凍的50 μL DH5α感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30 min后，42 ℃熱激90 s，冰上靜置2 min，直接涂于氨芐抗性的平板。第2天，挑選出生長狀況良好的單菌落于20 mL含有氨芐抗性的LB培養液中，37 ℃ 200 r/min搖床培養過夜。取5 mL菌液送上海英濰捷基生物技術有限公司測序。

圖2　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA重組載體結構示意圖

1.4pCAG-T7-HIF-1α-gRNA對肝癌細胞的轉染

按照試劑盒說明書提取陽性質粒，將3個構建好的重組質粒用TE buffer稀釋至等濃度后等體積混合，測定濃度后待用。將處于生長狀態良好的人肝癌細胞HepG2和SK-Hep-1(購自上海中科院細胞庫)分別消化后接種至12孔板，融合達60%～80%時進行pCAG-T7-HIF-1α-gRNA轉染。3個重組質粒各取2 μg，分別在聚苯乙烯管中與100 μL Opti-MEM?培養基混合成預混液，室溫靜置5 min后在預混液中加入2 μL Easyfect，輕輕吹打，搖晃混勻，室溫孵育20 min。將配制好的DNA-脂質體復合物加入12孔板中，來回輕柔搖晃培養板，放入培養箱繼續培養。轉染24 h后,在熒光顯微鏡下觀察細胞GFP蛋白表達情況，評估轉染效率并拍照。轉染36～48 h后加入含嘌呤霉素(HepG2和SK-Hep-1最優篩選濃度分別為2.0和1.5 mg/L)的無抗生素培養基,48 h后更換為最優篩選濃度一半的嘌呤霉素的新鮮無抗培養基維持10～15 d,篩選出基因敲除的混合克隆細胞株。

1.5細胞中HIF-1α蛋白的Western blot法檢測用HIF-1α表達誘導劑CoCl2(200 μmol/L)誘導培養未轉染的HepG2、SK-Hep-1以及混合克隆細胞24 h，提取蛋白，應用Western blot方法檢測HIF-1α蛋白的表達，以相應條帶灰度值表示表達水平。

2結果

2.1pCAG-T7-HIF-1α-gRNA的鑒定挑取的菌液經上海英濰捷基公司測序，所得序列與gRNA序列一致，測序比對結果見圖3。

2.2pCAG-T7-HIF-1α-gRNA對HepG2、SK-Hep-1細胞的轉染效果見圖4。

2.3基因敲除效果Western blot結果見圖5、表1?？梢钥闯觯崔D染細胞經CoCl2處理后可見明顯的HIF-1α表達，而基因敲除的混合克隆細胞HIF-1α表達明顯減弱。

圖3　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA測序結果

左:HepG2；右:SK-Hep-1。圖4　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA轉染效果圖

A:HepG2；B:SK-Hep-1;1：未轉染未誘導；2：未轉染+誘導；3轉染+誘導。圖5　Western blot結果

表1　轉染和未轉染細胞中HIF-1α蛋白表達水平的比較

*:與HepG2或SK-Hep-1比較，P<0.05；與HepG2+CoCl2或SK-Hep-1+CoCl2比較，P<0.05。

3討論

HIF-1是PAS(PER-ARNT-SIM)家族的成員之一,是一個以折疊-環-折疊為基礎結構的轉錄因子家族，另外還包括結構相似的HIF-2和HIF-3。HIF-1為異源二聚體結構，由對氧含量敏感的HIF-1α亞基和結構性表達的HIF-1β亞基組成，通過與DNA結合發揮轉錄調節作用。HIF-1α亞基為特異性活性調節亞基，對氧的依賴性較強, 起到主要的缺氧調節作用。在常氧條件下，HIF-1α蛋白合成后會很快被降解，不發揮作用[9]。然而,在缺氧的情況下,HIF-1α的脯氨酰羥化被阻斷,未被降解的HIF-1α進入細胞核, 與HIF-1β形成穩定的異質二聚體, 活化的HIF-1 在其靶基因的轉錄起始部位形成一個轉錄起始復合物, 從而啟動對靶基因的轉錄，繼而進一步發揮促進腫瘤細胞生長、侵襲、轉移和化療耐藥的作用[10]。HIF-1α是介導生理性和病理性低氧反應的關鍵轉錄因子, 在缺氧環境中表達相對顯著,活化的HIF-1作用于人類基因組的1%～2%基因,主要調節血管形成、細胞存活/死亡、代謝、pH、黏附、細胞外基質重塑、遷徙和轉移等基因產物的表達，其表達與腫瘤的生長、浸潤、轉移和預后等密切相關, 并對腫瘤的治療具有重要意義[11]。目前研究[6]表明, HIF-1在由肝臟炎性疾病向肝臟惡性腫瘤的演進過程中發揮著重要的作用，故推測 HIF-1有可能為肝癌的治療提供新的靶點。為了進一步深入探索和研究HIF-1α在肝癌發生發展中的調控機制，該研究利用CRISPR/Cas9技術，在體外敲除人肝癌細胞HepG2和SK-Hep-1中的HIF-1α基因，并體外鑒定敲除效果。

CRISPR系統是由成簇間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)和Cas基因(CRISPR-associated genes)組成的系統[12]。CRISPR系統的原理是基于gRNA 序列能夠靶向識別與其互補的DNA 序列,并介導Cas9蛋白特異性地識別及切割該靶位點。同傳統的siRNA和shRNA基因沉默技術相比，CRISPR/Cas9技術能夠在基因水平實現對靶基因的敲除，更加穩定和徹底。與現有的其他基因編輯工具如鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)相比較，CRISPR/Cas9系統的載體構建更為簡單和便捷，只需設計并改造載體上的目的基因的sgRNA序列即可，并且具備更強的擴展性[13]。

實驗中，作者首先將設計好的能夠靶向HIF-1α基因的gRNA序列連入gRNA-Cas9體系載體中，構建靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9表達載體。該重組質粒編碼的Cas9蛋白帶有的核定位信號(nuclear localization signal，NLS)使其能夠與gRNA片段結合并組裝成gRNA-Cas9 復合體，在目標基因PAM元件的上游實現DNA雙鏈的斷裂，隨后細胞利用自身的易錯傾向的非同源末端連接(non-homologous end joining， NHEJ)修復，同源修復的過程中會在斷裂位點產生插入或缺失，繼而發生移碼突變，導致靶基因編碼的蛋白發生改變，從而達到基因敲除的效果。將構建成功的靶向HIF-1α的CRISPR/Cas9質粒轉染至肝癌細胞HepG2和SK-Hep-1中，利用抗性基因篩選獲得HIF-1α基因敲除的混合克隆細胞，再進一步用Western blot法檢測HIF-1α蛋白的表達情況。結果顯示未轉染細胞經CoCl2誘導后HIF-1α表達明顯升高，而混合克隆細胞HIF-1α未見明顯表達，提示HIF-1α基因敲除成功。

該研究成功構建了靶向HIF-1α的CRISPR/Cas9質粒載體，為下一步體內外水平敲除HIF-1α基因，進一步研究其在肝癌發生發展過程中的作用打下了前期基礎。

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Construction and indentification of CRISPR/Cas9 plasmid targeting HIF-1α gene

HEYuting1)，LIJuan1)，SUNRanran1)，CHENXiaolong1)，SHENShen1)，KANQuancheng2)，YUZujiang1)

1)DepartmentofInfectionDiseases，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofPharmacology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordsHIF-1α；CRISPR/Cas9；hepatocellular carcinoma；vector construction；gene knock-out

AbstractAim: To construct CRISPR/Cas9 knock-out plasmid targeting HIF-1α gene, and identify its knock-out effect in vitro.Methods: The gRNA sequences targeting HIF-1α gene were designed,then were inserted into CRISPR/Cas9 plasmid skeleton vector pCAG-T7,which was transformed into competent DH5α.The single clone was picked up and validated via sequencing. Then the constructed recombinant vector pCAG-T7-HIF-1α-gRNA was transfected into HepG2 and SK-Hep-1, and the HIF-1α gene knock-out mixed colony cell were selected using puromycin. Subsequently, the expression level of HIF-1α in the HIF-1α gene knock-out mixed colony cell lines was detected by Western blot. Results: Through the sequencing validation, the plasmids targeting HIF-1α gene was successfully constructed. The expression levels of HIF-1α in HepG2 and SK-Hep-1 transfected with the recombinant vector were significantly reduced.Conclusion: CRISPR/Cas9 plasmid targeting HIF-1α gene has been successfully constructed.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.002

#通信作者，男，1971年5月生，教授，博士生導師，研究方向：重癥肝炎和肝癌的綜合治療，E-mail:johnyuem@zzu.edu.cn

中圖分類號Q781

*河南省科技廳創新人才基金項目124100510010；鄭州大學第一附屬醫院青年基金項目(2013年)