5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性>*

張　翠，黃艷梅#, 張藝佳，馬亞磊，李　茜，郭　棟，莫曉婷，趙興春

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系法醫(yī)物證學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003　2)公安部物證鑒定中心法庭科學(xué)技術(shù)應(yīng)用研究中心 北京 100038

5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性>*

張翠1)，黃艷梅1)#, 張藝佳1)，馬亞磊1)，李茜1)，郭棟1)，莫曉婷2)，趙興春2)

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系法醫(yī)物證學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 4530032)公安部物證鑒定中心法庭科學(xué)技術(shù)應(yīng)用研究中心 北京 100038

關(guān)鍵詞五核苷酸；Y-STR基因座；單體型；遺傳多態(tài)性；法醫(yī)學(xué)

摘要目的：調(diào)查Y染色體上5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座DYS446、DYS447、DYS463、DYS588和DYS643在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性，評(píng)價(jià)其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。方法：收集403名河南漢族無(wú)關(guān)男性個(gè)體血樣，檢測(cè)上述5個(gè)基因座，進(jìn)行等位基因分型及遺傳統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：5個(gè)Y-STR基因座分別檢出了11、9、7、9和6個(gè)等位基因，其中DYS446和DYS447基因多樣性(GD)達(dá)0.815 14和0.843 96，DYS463和DYS643的GD達(dá)0.777 18和0.720 60。共檢測(cè)到311種單體型，其中261種單體型僅出現(xiàn)1次，個(gè)體識(shí)別力(DP)和單體型多樣性(HD)分別為0.995 45和0.997 93,單體型辨別能力(DC)為0.771 71。結(jié)論：5個(gè)基因座組成的單體型在河南漢族群體中具有較高的遺傳多態(tài)性，對(duì)于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐應(yīng)用和人類遺傳學(xué)研究具有重要意義。

Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)遺傳標(biāo)記具有分型簡(jiǎn)單、易于擴(kuò)增、呈父系遺傳和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在法醫(yī)實(shí)踐中成為分析混合斑[1]、微量降解等生物檢材[2]的個(gè)人識(shí)別和父系男性成員間親權(quán)鑒定的重要手段。核心序列為五核苷酸的Y-STR基因座具有在復(fù)合擴(kuò)增中優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增少等優(yōu)點(diǎn)，在法醫(yī)實(shí)踐應(yīng)用時(shí)具有一定的優(yōu)勢(shì)。目前報(bào)道的五核苷酸Y-STR 基因座有十幾個(gè)，相對(duì)常用的四核苷酸Y-STR基因座，有關(guān)五核苷酸Y-STR基因座群體資料的研究較少。作者根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.com)和有關(guān)報(bào)道[3-4]，選擇了5個(gè)五核苷酸Y-STR遺傳標(biāo)記：DYS446、DYS447、DYS463、DYS588和DYS643，調(diào)查其在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性，從而為其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐和人類學(xué)研究中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1樣本來(lái)源及處理知情同意情況下，采集403名河南漢族無(wú)關(guān)男性個(gè)體血樣(確定3代以內(nèi)均在河南生活)；用常規(guī)有機(jī)酚/氯仿方法提取基因組DNA。

1.2五核苷酸Y-STR基因座基本信息及引物序列

根據(jù)文獻(xiàn)[4-6]完善5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座的基本遺傳信息。用Primer Primier v5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用TAMRA和6-FAM兩種熒光染料標(biāo)記引物(表1), 由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.3PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包含1×Taq DNA聚合酶緩沖液， 1.5 mmol/L MgCl22.5 μL， 2 mmol/L dNTPs 1 μL,10 μmol/L引物，10～50 ng DNA模板,1 U Taq Plus DNA聚合酶。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 45 s,55～64 ℃退火 45 s(表1),72 ℃ 45 s,32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；產(chǎn)物于4 ℃保存。取1 μL PCR產(chǎn)物、0.3 μL 內(nèi)標(biāo)SIZ500和10 μL去離子甲酰胺混合均勻，95 ℃變性后，置ABI 3130遺傳分析儀上進(jìn)行全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，用GeneMapper?ID v3.5軟件對(duì)等位基因進(jìn)行分型。

表1　5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座基本信息及引物序列

1.4等位基因的分型依據(jù)

1.4.1等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備分別回收5個(gè)基因座經(jīng)60 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳后的等位基因片段，放入500 μL EP 管中,加入50～100 μL 0.5×TE后混勻過夜，然后取3.0 μL作為模板，按1.3所述條件進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物按比例混勻。

1.4.2等位基因的命名分離后的各基因座不同等位基因片段由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，按照國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)DNA委員會(huì)推薦的命名原則進(jìn)行命名[7]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各指標(biāo)計(jì)算公式[8]如下：基因多樣性(gene diversity, GD)=n(1-∑Pi2)/(n-1),Pi為群體中每一種等位基因頻率。單體型多樣性(haplotype diversity,HD)=n(1-∑Pi2)/(n-1),Pi為群體中每一種單體型的頻率。個(gè)體識(shí)別力(the discrimination power，DP)= 1-∑Pi2。單體型辨別能力(discrimination capacity，DC)=n/N,N為樣本數(shù)，n為不同的單體型個(gè)數(shù)。

2結(jié)果

2.15個(gè)五核苷酸Y-STR基因座的測(cè)序結(jié)果見圖1。DYS446、DYS588和DYS643屬于簡(jiǎn)單重復(fù)序列， DYS447和DYS463屬于復(fù)合序列。

從上到下依次為DYS446(反向)、DYS447(反向)、DYS463(正向)、DYS588(反向)、DYS643(反向)。圖1　5個(gè)基因座重復(fù)序列的部分測(cè)序圖譜

2.25個(gè)五核苷酸Y-STR基因座的等位基因頻率及GD、DP值見表2。403名河南漢族個(gè)體中DYS446、DYS447、DYS463、DYS588、DYS643分別出現(xiàn)11、9、7、9和6個(gè)等位基因，其中DYS446和DYS447基因座的多樣性較高，DYS463和DYS643基因座多樣性相對(duì)較高，DYS588基因座等位基因分布集中于等位基因13(頻率高達(dá)0.720 60)。

表2　5個(gè)基因座的等位基因頻率及GD值

“-”表示未檢測(cè)到。

2.35個(gè)五核苷酸Y-STR基因座組成的單體型及單體型頻率在河南漢族群體403例無(wú)關(guān)男性個(gè)體中，5個(gè)基因座(DYS446、DYS447、DYS463、DYS588和DYS643)組成的單體型有311種，其中261(83.92%)種單體型只出現(xiàn)1次，單體型頻率為0.002 5，出現(xiàn)最多的單體型是15-24-22-11-13和15-23-22-12-13,HD、DP和DC分別為0.997 93、0.995 45和0.771 71。

3討論

該研究調(diào)查了5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性，其中DYS446和DYS447的多態(tài)性較高，GD值及DP值均大于0.8;DYS463和DYS643多態(tài)性相對(duì)較高；DYS588的GD值和DP值小于0.5，在實(shí)際應(yīng)用中慎用。5個(gè)基因座組成的單體型數(shù)目比DYS463、DYS588和DYS643組成的單體型數(shù)目增加220種，HD值和DP值分別提高到0.997 93和0.771 71。因此，可以認(rèn)為，DYS446和DYS447基因座對(duì)提高5個(gè)基因座的HD和PD發(fā)揮了重要作用[9]。根據(jù)Ballantyne等[10]的報(bào)道：在父系遺傳過程中隨著重復(fù)單位長(zhǎng)度的增加，突變率會(huì)相應(yīng)降低，該研究未發(fā)現(xiàn)河南漢族人群中DYS643和DYSYS446基因座存在稀有等位基因11.1[11]和15.1[12]，提示這2個(gè)基因座在河南漢族群體中遺傳相對(duì)穩(wěn)定，可重復(fù)性較好。國(guó)外有類似報(bào)道，如利用DYS643基因座的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合其他Y-STR基因座進(jìn)行群體研究[5]和將DYS643作為參考基因座進(jìn)行突變率研究[13]等。Promega公司研發(fā)的PowerPlex Y23 System (PPY23)試劑盒[14]添加了DYS643基因座，并對(duì)多個(gè)群體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)具有較高的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。因此，DYS446、DYS447和DYS643基因座具有穩(wěn)定性好和多態(tài)性高等優(yōu)勢(shì)，可以作為法醫(yī)實(shí)踐中Y-STR遺傳標(biāo)記應(yīng)用的候選基因座。

通過對(duì)5個(gè)基因座遺傳多態(tài)性分析,一方面在一定程度上補(bǔ)充了河南漢族群體的Y-STR資料，如與張秀華等[15]的研究比較，發(fā)現(xiàn)在河南漢族群體中存在4個(gè)新的DYS446等位基因，分別是8、19、20和21，其中等位基因8只出現(xiàn)1次，等位基因頻率為0.002 5。另一方面也發(fā)現(xiàn)了部分差異，如與胡泊等[16]研究的潮汕漢族群體比較發(fā)現(xiàn)，在河南漢族群體中DYS588出現(xiàn)稀有等位基因6和9；同張永吉等[17]研究的中國(guó)朝鮮族進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了等位基因8、20和21，但并未發(fā)現(xiàn)張永吉等提到的只在漢族群體中出現(xiàn)的等位基因10，因此還需要更多的研究來(lái)分析該等位基因在河南漢族群體中是否存在。

該研究中，這5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座在河南漢族群體中的HD為0.997 93，DC達(dá)到0.771 71，說明這5個(gè)基因座組成的單體型在河南漢族群體中具有較高的遺傳多態(tài)性。

綜上所述，DYS446、DYS447、DYS463和DYS643在河南漢族群體中具有較好的多態(tài)性，可以應(yīng)用于河南漢族群體法醫(yī)學(xué)實(shí)踐和人類遺傳學(xué)研究。

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Genetic polymorphism of five pentanucleotide Y-STR markers in Henan Han population

ZHANGCui1),HUANGYanmei1),ZHANGYijia1),MAYalei1),LIXi1),GUODong1),MOXiaoting2),ZHAOXingchun2)

1)DepartmentofForensicGenetics,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang4530032)ForensicScienceApplicationTechnologyResearchCenter,InstituteofForensicScienceMinistryofPublicSecurity,Beijing100038

Key wordspentanucleotide;Y-STR marker;haplotype;genetic polymorphism;forensic science

AbstractAim: To investigate the genetic polymorphism of five pentanucleotide Y-STR loci(DYS446, DYS447, DYS463, DYS588 and DYS643) in Henan Han population and to assess their value in forensic science. Methods: A total of 403 unrelated males from Henan Han population were subjected to detect and analyze the five loci mentioned above. Results: There were 11, 9, 7, 9 and 6 alleles were detected for the five loci,respectively.The gene diversity of DYS446, DYS447, DYS463, and DYS643 was 0.815 14,0.843 96,0.777 18 and 0.720 60,respectively. A total of 311 haplotypes were found, among which 261 haplotypes were detected only once. The haplotype diversity, discrimination power and discrimination capacity were 0.997 93, 0.995 45 and 0.771 71, respectively.Conclusion: The haplotype composed of the five pentanucleotide loci were highly polymorphic in Henan Han population, and is of great significance in forensic science and human genetics studies.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.003

#通信作者，女，1971年5月生，博士，教授，研究方向：法醫(yī)分子遺傳學(xué)，E-mali:hym_cn@hotmail.com

中圖分類號(hào)R89

*河南省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目13A310849；河南省教育科學(xué)“十二·五”規(guī)劃立項(xiàng)重點(diǎn)課題2013-JKGHB-0035; 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院培育

基金重點(diǎn)項(xiàng)目2013ZD114