河南某工廠附近農田土壤中抗生素抗性基因與可移動遺傳元件的分布>*

劉　佳，趙小學，李紅萍，程學敏，巴　月，李慶波，丁記者，朱靜媛#，趙宗生#

1)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 450001　2)濟源市重金屬監測與污染治理重點實驗室 濟源 459000

河南某工廠附近農田土壤中抗生素抗性基因與可移動遺傳元件的分布>*

劉佳1)，趙小學2)，李紅萍1)，程學敏1)，巴月1)，李慶波1)，丁記者1)，朱靜媛1)#，趙宗生2)#

1)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 4500012)濟源市重金屬監測與污染治理重點實驗室 濟源 459000

關鍵詞農田土壤；抗生素抗性基因；可移動遺傳元件；河南省；水平基因轉移

摘要目的：觀察河南某工廠附近農田土壤中抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的分布。方法：分別于不同時間點采集河南某工廠主導風向下風向上距離為700～2 500 m不等的7塊農田土壤的土樣，提取總DNA，采用PCR法檢測15種抗生素抗性基因(包括四環素類藥物抗性基因tetA、tetC、tetE、tetM、tetQ、tetW，磺胺類藥物抗性基因sulⅠ、sulⅡ，β內酰胺類藥物抗性基因bla-TEM、SHV、CTX-M-1，喹諾酮類藥物的抗性基因qnrA、qnrB、qnrS，鏈霉素類藥物抗性基因strA)和4種可移動遺傳元件(包括整合酶基因intI1、intI2，插入序列共同區基因orf513、ISCR2)，PCR陽性產物送測序，通過BLAST與GenBank數據庫進行同源性比對。結果：共檢出8種抗生素抗性基因，分別是sulⅡ、tetC、bla-TEM、sulⅠ、tetA、strA、tetM和tetW；3種可移動遺傳元件intI1、intI2、ISCR2。各PCR擴增陽性產物經測序比對后，與GenBank已有序列識別度為95%～100%。各基因在不同距離土樣中的陽性率比較差異均無統計學意義(P>0.05)，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1在不同時間點的土樣中陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論：該工廠附近農田土壤中常見抗生素抗性基因及可移動基因元件為sulⅡ、tetC、bla-TEM、sulⅠ和intI1，除sulⅠ外，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1的分布均具有時間差異，但在不同距離農田土壤中分布穩定。

2006年，Pruden等[1]提出將抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作為一種新型的環境污染物。攜帶ARGs的土壤微生物是環境中ARGs的主要貯存庫之一[2]，被稱為土壤抗生素抗性組。通過基因的水平轉移(lateral/horizontal gene transfer, L/H GT)，ARGs可能在環境微生物和臨床病原體之間進行轉移、交換，給人類健康帶來巨大的威脅。可移動遺傳單元(mobile genetic elements, MGEs)包括質粒、轉座子、插入序列等，是各種ARGs在不同微生物之間進行基因轉移、擴散的工具。現有研究[3-4]大多集中在畜禽養殖場及其周邊環境、受污染河流及其底泥中ARGs的檢測，對普通農田土壤中ARGs及MGEs的分布研究較少。研究[5]表明，新鮮農產品上可以檢測出抗生素抗性菌和不同的ARGs；農田新鮮蔬菜和超市蔬菜上檢出細菌的抗生素抗性不同[6]；施肥對土壤及蔬菜上抗生素抗性細菌、ARGs的分布有明顯影響[7]。該研究在不同時間點對距河南某工廠不同距離的農田土壤中的ARGs及MGEs進行檢測，嘗試分析其空間、時間分布規律。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器Soil DNA 提取試劑盒(OMEGA公司)，2×Taq PCR Master Mix(康為世紀生物科技有限公司)，Lab Cycler PCR儀(德國圣歐國際有限公司)，DYY-6型電泳儀(北京六一儀器廠)，Gene Genius凝膠成像系統(Gene公司)，超微量分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo公司)。

1.2土壤樣品采集按照《土壤環境監測技術規范》(HJ/T 166-2004)，于2014年3月(t1)、6月(t2)、10月(t3)和2015年1月(t4)，在河南省某地某有色金屬、貴金屬冶煉加工廠常年主導風向的下風向，根據距離煙囪的位置由近及遠選擇7塊農田土壤，距離分別約為700、900、1 500、1 600、1 700、2 100、2 500 m，分別編號為G1～7號采樣區。在每個采樣區采用梅花點布點法分別采集5個點的土樣，去除土壤表面雜質，采樣锨垂直入土，采集深度15～20 cm，采取表層土樣約1 kg，將5個點的土樣在牛皮紙上均勻混合，采用四分法取得混合土樣，用高壓滅菌的EP管收集混合土樣約100 g以備DNA提取，同時做好采樣記錄和采樣標記。

1.3土壤樣本總DNA的提取及ARGs、MGEs檢測采用優化的脫腐方案[8]對土樣進行預處理后，用Soil DNA提取試劑盒提取土壤樣本的總DNA，用超微量分光光度計檢測含量以及純度，確定總DNA提取質量。PCR檢測15種ARGs，包括四環素類藥物抗性基因tetA、tetC、tetE、tetM、tetQ、tetW，磺胺類藥物抗性基因sulⅠ、sulⅡ，β內酰胺類藥物抗性基因bla-TEM、SHV、CTX-M-1，喹諾酮類藥物抗性基因qnrA、qnrB、qnrS，鏈霉素類藥物抗性基因strA；4種MGEs，包括整合酶基因intI1、intI2，插入序列共同區基因orf513、ISCR2。引物序列見表1。PCR反應總體系25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，終濃度0.25 μmol/L的上、下游引物共2.5 μL，模板DNA 1 μL， ddH2O 9 μL。擴增條件：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性50 s，50 ℃退火50 s, 72 ℃延伸50 s，30個循環;72 ℃充分延伸10 min。取5 μL擴增產物在10 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。PCR陽性產物送鉑尚生物公司測序，測序結果與GenBank數據庫進行BLAST同源性比對。

表1　PCR擴增引物序列信息

1.4統計學處理采用SPSS 21.0進行分析，不同時間點、不同采樣點土樣上述基因陽性率的比較采用Fisher精確概率法，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1PCR檢測及測序分析結果經PCR共檢測出8種ARGs、3種MGEs陽性，見圖1。8種ARGs的陽性率分別是sulⅡ(22/28，78.6%)、tetC(22/28，78.6%)、bla-TEM(18/28，64.3%)、sulⅠ(15/28，53.6%)、tetA(11/28，39.3%)、strA(9/28，32.1%)、tetM(6/28，21.4%)和tetW(3/28，10.7%)。3種MGEs的陽性率分別是intI1(18/28，64.3%)、intI2(3/28，10.7%)和ISCR2(7/28，25.0%)。將測序結果與GenBank數據庫中已發表的序列進行BLAST序列比對，發現其序列與廣泛分布于環境的條件致病菌(嗜麥芽寡養單胞菌、鮑氏不動桿菌)，動物致病菌(豬鏈球菌)，環境中不可培養微生物以及臨床常見致病菌(大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌)具有高度同源性，識別度達95%～100%。測序后序列上傳GenBank，登錄號分別為KT625465、KT625466、KT625467、KT625468、KT625469、KT625470、KT625471、KT625472、KU940035、KU940036、KU940037。

M：Marker；1：sulⅡ；2：ISCR2；3：tetC；4：tetM；5：tetW；6：sulⅠ；7：intI1；8：intI2；9：bla-TEM；10：tetA；11：strA。圖1　PCR擴增的ARGs和MGEs陽性產物的電泳結果

2.2不同時間點、不同采樣點土樣中ARGs和MGEs的分布各土壤樣本不同時間點所檢測的ARGs和MGEs陽性基因譜見表2。檢測陽性的各基因在不同距離土樣中的陽性率差異均無統計學意義，見表3。檢測陽性的各基因在不同時間點的分布情況見表4，由表4可知，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1在不同時間點的土樣中檢出陽性率差異有統計學意義。

表2　不同采樣點4個時間點檢測ARGs和MGEs陽性基因譜(總數)

表3　不同采樣點ARGs

表4　不同時間點ARGs

3討論

ARGs的分布與播散與MGEs的存在緊密相關，因此該研究對土壤樣本中的ARGs及MGEs都做了檢測。該研究選擇檢測的15種ARGs包括了臨床和養殖獸藥中較早使用而且消費量較高的幾種抗生素抗性基因，如針對磺胺類抗生素、四環素類抗生素和β-內酰胺類抗生素抗性基因sulⅠ、sulⅡ、tetA、tetM、tetW、tetC、bla-TEM等。結果發現這幾種抗生素的ARGs檢測陽性率較高，分別是sulⅡ(78.6%)、tetC(78.6%)、bla-TEM(64.3%)和sulⅠ(53.6%)。

四環素類抗生素是目前世界上用量最大、使用最廣泛的抗生素種類之一，除了很早就在臨床使用，還作為獸藥和促生長劑大量用于畜禽養殖業和水產養殖業等，因此在環境特別是土壤環境中的殘留情況令人矚目。海邊漁場的底泥中[9]、廢水處理廠的入廠水與出廠水中[10]、養豬場附近的農田土壤中[11]等都曾發現此類ARGs高豐度的分布，提示與四環素類抗生素的環境污染和殘留緊密相關。該研究中7塊土壤的混合樣本中都檢測出tetC，tetA、tetM、tetW也有不同程度的檢出，與以上研究結果相符。

與四環素類抗生素一樣，磺胺類ARGs經常被檢測到且檢出頻率非常高，二者均已經被證實廣泛分布于糞便、廢水以及糞便施肥的土壤中和廢水處理廠等環境中[10,12]。該研究中sulⅡ在7塊土壤的混合樣本中的檢出率與tetC一樣最高，為78.6%，與以往的研究結果一致。

bla-TEM作為編碼β-內酰胺類抗生素抗性的基因，是最廣為人知的一類ARGs，從20世紀60年代至今在臨床已發現170多種變異，近年來有被CTX-M型取代為主要流行型的趨勢。關于bla-TEM分布的研究[10]主要集中于臨床分離致病菌(如大腸埃希菌)的耐藥性研究，在環境中的分布主要見于廢水處理廠，在農田土壤中的研究報道少見，而在該研究中7塊土壤的混合樣本中都檢測出bla-TEM，提示這種臨床常見ARGs可能通過L/H GT進入了土壤自然環境中，這也與該研究中發現的多個MGEs檢出陽性的結果相符。

IntI1、intI2、ISCRs是常見的可能參與L/H GT的一類MGEs。有研究[13-14]表明intI1、intI2在肉雞養殖場的土壤樣本中與多種ARGs的分布呈現一致性，其豐度又與土壤樣本中抗生素含量、某些金屬含量等正相關；而在農藥污染的土壤樣本中也發現有intI1、intI2的存在，提示ARGs及MGEs的分布可能是多種環境因素共同選擇的結果。目前ISCR1(即orf513)和ISCR2是臨床分離多重耐藥致病菌的研究熱點，但在自然環境中的檢測不多。該研究檢測出了intI1(64.3%)、intI2(10.7%)和ISCR2(25.0%)3種基因，提示多種MGEs共存影響土壤環境中ARGs的分布。

綜上所述，該工廠附近農田土壤中常見ARGs及MGEs為sulⅡ、tetC、bla-TEM、sulⅠ和intI1，除sulⅠ外，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1分布具有時間差異，但不同距離農田土壤中各基因的陽性率和種類分布穩定。同時該研究發現sulⅡ和intI1、tetC和bla-TEM存在相似的時間分布趨勢，提示它們具有相似的來源或傳播途徑，下一步可通過基因定量研究探索。此外，對測序結果的BLAST比對分析發現，土壤環境中ARGs及MGEs分布和來源復雜，如何預防及控制ARGs的分布和擴散尚需更多的研究。

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(2015-09-02收稿責任編輯徐春燕)

Prevalence of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in farmland soil near a factory of a certain city in Henan Province

LIUJia1),ZHAOXiaoxue2),LIHongping1),CHENGXuemin1),BAYue1),LIQingbo1),DINGJizhe1),ZHUJingyuan1),ZHAOZongsheng2)

1)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)JiyuanCityKeyLaboratoryofHeavy-MentalMonitoringandPollutionControl,Jiyuan459000

Key wordsfarmland soil;antibiotic resistance gene;mobile genetic element;Henan Province;lateral/horizontal gene transfer

AbstractAim: To investigate the prevalence of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in farmland soil near a factory of a certain city in Henan Province.Methods: Mixed soil samples of 7 pieces of farmland with different distance(700-2 500 m) from a factory at different time points in Henan Province were collected and total DNA was extracted by DNA extraction kit. Fifteen kinds of antibiotic resistance genes and 4 kinds of mobile genetic elements were detected by PCR，which included tetracycline resistance genes(tetA,tetC,tetE,tetM,tetQ,tetW),sulfonamides resistance genes(sulⅠ,sulⅡ), β-lactam resistance genes(bla-TEM,SHV,CTX-M-1), quinolones resistance genes(qnrA,qnrB,qnrS), streptomycin resistance gene(strA), class 1 and class 2 integron genes(intⅠ1,intⅠ2), and insertion sequence common region genes(orf513,ISCR2). Positive products of PCR were sequenced and compared with sequences in GenBank database by BLAST software.Results: Eight antibiotic resistance genes were found positive including sulⅡ, tetC, bla-TEM, sulⅠ, tetA, strA, tetM and tetW. Mobile genetic elements intI1, intI2, and ISCR2 were positive in 7 pieces of farmland. All sequences identified had greater than 95% homology with genes in GenBank by BLAST software. Genes positive rates from different soil samples were not found significantly different(P>0.05), however, positive rates of sulⅡ, tetC, bla-TEMand intI1 in different time points were significantly different(P<0.05).Conclusion: Antibiotic resistance genes and mobile genetic elements sulⅡ, tetC, bla-TEM，intI1 and sulⅠ are found common in farmland near the factory. The distributions of sulⅡ, tetC, bla-TEMand intI1 except sulⅠ may vary with time and stabilize in the soil with different distance to the factory.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.004

#通信作者：朱靜媛，女，1976年11月生，博士，副教授，研究方向：環境相關疾病及生物標志，E-mail:yuanzhu@zzu.edu.cn；趙宗生，男，1971年11月生，本科，工程師，研究方向：環境監測，E-mail:hnjyhbzs818@sina.com

中圖分類號R124

*國家自然科學基金青年科學基金資助項目81202174