河南農村地區漢族2型糖尿病人群VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點基因多態性檢測>*

蔣鴻琳，李　靜，于　斐，巴　月，王重建，玉崧成，王　艷，趙林遠，李文杰#

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001　2)河南科技大學第一附屬醫院臨床營養科 洛陽 471000　3)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 450001　4)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001

河南農村地區漢族2型糖尿病人群VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點基因多態性檢測>*

蔣鴻琳1)，李靜2)，于斐1)，巴月3)，王重建4)，玉崧成1)，王艷1)，趙林遠1)，李文杰1)#

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 4500012)河南科技大學第一附屬醫院臨床營養科 洛陽 4710003)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 4500014)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001

關鍵詞2型糖尿病；維生素D受體；單核苷酸多態性；河南；農村

摘要目的：探討河南農村地區漢族人群維生素D受體(VDR)基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點基因多態性與2型糖尿病(T2DM)的關系。方法：采用RCR-RFLP技術檢測河南省漢族人群中286例T2DM患者、286例健康對照VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點的多態性。分析2組間Apa Ⅰ和Taq Ⅰ等位基因、基因型和單倍體型分布與T2DM的關系。結果：2組間Apa Ⅰ等位基因頻率差異有統計學意義(P=0.036)，T等位基因攜帶者患T2DM的風險是未攜帶者的1.328倍(95%CI=1.018～1.733)。2組間Taq Ⅰ等位基因和基因型分布差異均無統計學意義(P>0.05)。Apa Ⅰ和Taq Ⅰ之間存在連鎖不平衡(D′=0.744)，其中，單倍體型Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT在病例組的分布頻率高于對照組[χ2=7.313，OR(95%CI)=1.485(1.114～1.981),P<0.05]。結論：在河南農村漢族人群中，VDR基因Apa Ⅰ位點的等位基因T和單倍體型TT可能是T2DM的遺傳易感因素。

糖尿病是全球性的公共衛生問題，預計到2030年全球糖尿病的患病人數將達4.39億[1]。據2010年一項全國糖尿病患病率現況抽樣調查結果[2]估計，中國成人糖尿病總數已達1.13億，患病率高達11.6%。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是公認的由遺傳與環境因素共同作用的代謝紊亂性疾病，遺傳易感性對T2DM的發病機制十分重要[3-4]，目前已發現至少200多種基因與T2DM存在相關性。研究[5-7]發現維生素D是維持正常的胰島素分泌和糖耐量所必需的物質，能影響胰島β細胞的功能，在糖尿病的發生發展中發揮重要作用，其生物活性通過與維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)結合而實現。VDR是一種配體激活的轉錄調節蛋白，與1,25-(OH)2D3結合后形成的復合物可特異性識別并結合靶基因上游調控區的DNA序列，從而調控下游基因的轉錄，產生一系列諸如調節鈣磷代謝、促進細胞分化凋亡的生物學效應。近年來國內外多項研究[8-9]報道VDR基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)與維生素D代謝水平、胰島素敏感性和T2DM存在一定的關聯。該研究選取VDR基因上常見的兩個SNP位點Apa Ⅰ(rs7975232,G>T)和Taq Ⅰ(rs731236,T>C)，從基因水平進一步探討VDR變異與河南農村地區漢族人群T2DM易感性的關系。

1對象與方法

1.1研究對象以村為單位，采用整群抽樣的方法從河南省鄭州市二七區侯寨鄉、焦作市武陟縣選取18～87歲漢族T2DM患者286人，相互間無親緣關系，無其他自身免疫性疾病史，納入病例組;依據WHO(1999年)糖尿病診斷標準，既往有T2DM史且正在進行降糖治療，或2次空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，并排除1型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊類型糖尿病者[10]；研究同時排除此次調查中60歲以上新診T2DM患者。對照人群選自和病例同一村民組、年齡±5歲、同性別、無相關慢性疾病或自身免疫性疾病者。相關研究設計經鄭州大學倫理委員會審核通過，所有研究對象均知情同意。

1.2血樣的采集與處理抽取研究對象空腹靜脈血約10 mL，其中5 mL分離、分裝血漿，采用全自動生化分析儀測定血漿葡萄糖水平； 5 mL抗凝血采用百泰克公司提供的DNA提取試劑盒提取人白細胞基因組DNA。

1.3VDR基因分型方法采用RCR-RFLP法。由于VDR兩個SNP位點Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位于同一擴增片段上，因此二者共用一對引物。上游引物序列為5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’，下游引物序列為5’-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC-3’。取DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Mix 7.5 μL，超純水4.5 μL，總反應體系15 μL。PCR擴增條件：94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環31次。擴增完成后，向反應體系中加入內切酶0.5 μL、Buffer 1 μL，混勻后Apa Ⅰ位點酶切體系于37 ℃水浴，Taq Ⅰ位點酶切體系于65 ℃水浴，反應3 h后，點樣電泳，在凝膠成像系統中記錄結果，分析Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點基因型。

1.4數據處理運用EpiData 3.0進行雙人雙錄并核查。采用SPSS 21.0分析數據，對對照人群的基因型頻數進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，采用χ2檢驗分析病例組和對照組基因型分布，SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)進行等位基因關聯度分析[以Lewontin′sD′值(D′)>0.7為有意義]和單倍體型分析。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗結果Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點在對照人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.347和5.594，P均>0.05)。

2.2VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點基因型分析

Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點的PCR-RFLP電泳結果見圖1、2。Apa Ⅰ位點PCR擴增產物酶切后有3種基因型，野生純合型GG(528、217 bp)，突變雜合型GT(745、528、217 bp)，突變純合型TT(745 bp)。Taq Ⅰ位點擴增產物酶切后有3種基因型，野生純合型TT(494、251 bp)，突變雜合型TC(494、293、251、201 bp)，突變純合型CC(293、251、201 bp)。

1：TT;2、6、7：GG;3～5、8：GT;9：Marker。圖1　VDR基因Apa Ⅰ位點電泳結果圖

1：TC;2：CC;3：TT;4：Marker。圖2　VDR基因Taq Ⅰ位點電泳結果圖

2.3VDR基因多態性與T2DM的關系結果見表1、2。由表1、2可知，兩組基因型分布差異無統計學意義。Apa Ⅰ位點突變型等位基因T攜帶者患T2DM的風險是未攜帶者的1.328倍[OR(95%CI)=1.328(1.018～1.733)]。

表1　2組VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點基因型的分布

表2　2組VDR基因

2.4等位基因關聯度分析結果顯示Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點間D′值為0.744，可以認為Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點之間存在連鎖不平衡，且構成一個單倍體域。

2.5VDR基因單倍體型與T2DM的關系應用SHEsis在線軟件對Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點可構建4種單倍體型(Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GC、GT、TC、TT)，系統默認頻率3%以上為有意義的單倍體型，最終結果顯示3種單倍體型有意義，即Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT、TC和TT。以Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GC作為參照進行比較，病例組中Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT的頻率低于對照組，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT的頻率在病例組中較高，提示Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT可能對T2DM具有保護性作用，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT與T2DM發病風險的升高存在關聯性。見表3。

表3　病例組與對照組

3討論

不同研究結果表明，VDR基因多態性存在種族和地區的差異。對于Apa Ⅰ位點，國內外多項研究[11-13]證實其多態性與葡萄糖耐量相關，而與T2DM的關系存在爭議。APa Ⅰ位于第8內含子，其多態性不直接影響編碼蛋白的氨基酸序列，但可能通過影響mRNA穩定性而影響VDR蛋白的合成[11]。該研究中ApaⅠ的基因型分布在病例組和對照組間差異無統計學意義，這與安徽地區的研究結果[14]相同，但等位基因頻率分布差異有統計學意義，提示其等位基因T可能是河南漢族群體T2DM的易感基因，其多態性或與T2DM其他相關基因存在連鎖不平衡。該研究結果還顯示，在河南農村地區的漢族人群中，Taq Ⅰ位點不同基因型和等位基因頻率在病例組和對照組中差異均無統計學意義，與寧夏地區的研究[15]結果相似。Taq Ⅰ位點位于第9外顯子上，由于Taq Ⅰ多態性導致的是同義突變，編碼的蛋白質并未產生變化，故可能并未影響合成的VDR蛋白與配體結合的功能。此外，對Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位點等位基因的關聯分析發現，二者間存在顯著的連鎖不平衡，構成的單倍體型Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT在對照組的頻率分布高于病例組，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT在病例組的分布頻率則更高，提示這兩種單倍體型與T2DM密切相關，Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT可能是河南農村地區漢族人群T2DM的遺傳易感因素。而單獨分析時兩者的基因型分布與T2DM均不存在相關性，說明Apa Ⅰ和TaqⅠ位點多態性對T2DM獨立影響的作用較小，但可能通過基因間相互作用影響T2DM。單倍體型分析可能較單個SNP位點的分析更具說服力。

綜上所述，河南農村地區漢族T2DM人群中VDR基因多態性和T2DM發病存在相關性；VDR基因Apa Ⅰ位點的等位基因T和Apa Ⅰ-TaqⅠ單倍體型TT可能是T2DM的遺傳易感因素。在基因水平上的研究應更重視基因與基因間的聯合作用。T2DM同時受到環境因素的影響，因此該研究為后續進一步探討基因與環境的交互作用奠定了一定的基礎。

參考文獻

[1]SHAW JE,SICREE RA,ZIMMET PZ.Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract,2010,87(1):4

[2]XU Y,WANG LM,HE J,et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA,2013,310(9):948

[3]趙景志,李琳琳,龐超,等.鄭州地區2型糖尿病患者一級親屬遺傳度分析[J].鄭州大學學報(醫學版),2012,47(2):185

[4]何苗,傅倩晰,李會,等.中國人群LEPR基因多態性與2型糖尿病相關性的Meta分析[J].解放軍醫學雜志,2015,40(10):809

[5]MITRI J,DAWSON-HUGHES B,HU FB,et al.Effects of vitamin D and calcium supplementation on pancreatic β cell function, insulin sensitivity, and glycemia in adults at high risk of diabetes: the Calcium and Vitamin D for Diabetes Mellitus(CaDDM) randomized controlled trial[J].Am J Clin Nutr,2011,94(2):486

[6]CHENG Q,LI YC,BOUCHER BJ,et al.A novel role for vitamin D: modulation of expression and function of the local renin-angiotensin system in mouse pancreatic islets[J].Diabetologia,2011,54(8):2077

[7]朱麗穎,寧光.維生素D與2型糖尿病研究進展[J].中國實用內科雜志,2012,32(8):635

[8]JAIN R,VON HURST PR,STONEHOUSE W,et al.Association of vitamin D receptor gene polymorphisms with insulin resistance and response to vitamin D[J].Metabolism,2012,61(3):293

[9]WANG Q,XI B,REILLY KH,et al.Quantitative assessment of the associations between four polymorphisms(FokⅠ, ApaⅠ, BsmⅠ, TaqⅠ) of vitamin D receptor gene and risk of diabetes mellitus[J].Mol Biol Rep,2012,39(10):9405

[10]中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南:2013年版[J].中國醫學前沿雜志:電子版,2015,22(3):26

[11]侯麗君,邢鸝健,李廣紅,等.維生素D受體基因ApaI多態性與糖耐量減低的相關性[J].山東大學學報(醫學版),2014,52(6):51

[12]AL-DAGHRI NM,AL-ATTAS OS,ALKHARFY KM,et al.Association of VDR-gene variants with factors related to the metabolic syndrome, type 2 diabetes and vitamin D deficiency[J].Gene,2014,542(2):129

[13]LI L,WU B,LIU JY,et al.Vitamin D receptor gene polymorphisms and type 2 diabetes: a meta-analysis[J].Arch Med Res,2013,44(3):235

[14]ZHONG X,DU Y,LEI Y,et al.Effects of vitamin D receptor gene polymorphism and clinical characteristics on risk of diabetic retinopathy in Han Chinese type 2 diabetes patients[J].Gene,2015,566(2):212

[15]XU JR,YANG Y,LIU XM,et al.Association of VDR polymorphisms with type 2 diabetes mellitus in Chinese Han and Hui populations[J].Genet Mol Res,2014,13(4):9588

(2016-01-11收稿責任編輯徐春燕)

Detection of VDR gene Apa Ⅰ and Taq Ⅰ polymorphism in Han type 2 diabetes patients in Henan rural area

JIANGHonglin1),LIJing2),YUFei1),BAYue3),WANGChongjian4),YUSongcheng1),WANGYan1),ZHAOLinyuan1),LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofClinicalNutrition,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofScience&Technology,Luoyang4710003)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordstype 2 diabetes mellitus;vitamin D receptor;single nucleotide polymorphism;Henan Province;rural area

AbstractAim: To investigate the correlation of vitamin D receptor(VDR) gene at Apa Ⅰ and Taq Ⅰ with type 2 diabetes mellitus(T2DM) in Han population of rural area in Henan Province.Methods: PCR-RFLP method was carried out to examine the SNPs at Apa Ⅰ and Taq Ⅰ of VDR gene in 286 T2DM patients and 286 healthy controls in the Han population of Henan Province, then the distribution of allele, genotype and haplotypes between the two groups were compared.Results: The allelic frequencies of Apa Ⅰ had significant differences between the two groups(P=0.036). Individuals with allele T had a risk of 1.328 times as high as those without it(95%CI=1.018-1.733). However, the allelic frequencies and genotypic frequencies of Taq Ⅰ had no significant differences between the two groups(P>0.05). There was significant linkage disequilibrium between Apa Ⅰ and Taq Ⅰ(D′=0.744). The frequency of haplotype Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT was higher in the T2DM group than control group[χ2=7.313，OR(95%CI)=1.485(1.114-1.981),P<0.05].Conclusion: The allele T of Apa Ⅰ and the haplotype TT of Apa Ⅰ-Taq Ⅰ of VDR gene may be associated with higher T2DM susceptibility in Henan rural Han population.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.005

#通信作者，男，1958 年11月生，博士，教授，研究方向：營養相關慢性病，E-mail:lwj@zzu.edu.cn

中圖分類號R587.1

*“973”計劃前期研究專項2012CB526709；國家自然科學基金資助項目81573151，U1204823；河南省科技創新人才計劃項目154200510010