肌萎縮側索硬化患者腦脊液對U251細胞隧道納米管形成的影響>*

梁東曉，王雪晶，丁雪冰,何一昕，潘鵬偉，劉丹丹，滕軍放#

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052　2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

肌萎縮側索硬化患者腦脊液對U251細胞隧道納米管形成的影響>*

梁東曉1)，王雪晶1，2)，丁雪冰1，2),何一昕1)，潘鵬偉1)，劉丹丹1)，滕軍放1，2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 4500522)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

關鍵詞肌萎縮側索硬化；腦脊液；U251細胞；隧道納米管

摘要目的：探討肌萎縮側索硬化(ALS)患者腦脊液對神經膠質細胞隧道納米管(TNTs)形成的影響。方法：收集16例ALS患者的腦脊液(ALS-CSF)及10例功能性頭痛患者的腦脊液(對照)，分別用于培養U251細胞0、3、7、10、14 d，采用免疫熒光顯微鏡觀察TNTs的形成，記錄表達TNTs結構的U251細胞百分比，采用Western blot法檢測ALS-CSF培養0、3、7、10、14 d后U251細胞中F-actin蛋白的表達。結果：在ALS-CSF培養條件下, 表達TNTs結構的U251細胞百分比較對照組增加(P<0.05)，且表達TNTs結構的U251細胞百分比在3 d時開始增加，7 d時達到高峰，10 d時開始逐漸下降；ALS-CSF培養的U251細胞F-actin表達量在3 d時升高，在7 d時表達量最高，在10 d時開始下降。結論：ALS-CSF培養的U251細胞在早期可誘導TNTs的形成，可能促使ALS相關致病蛋白通過TNTs在中樞神經系統中播散。

肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是以選擇性,進行性上、下運動神經元損害并存為顯著特征的慢性神經系統變性疾病。臨床表現為自肢體遠端開始的非對稱性肌無力和肌萎縮，是成人運動神經元病最常見的類型。ALS發病機制不明。研究[1-2]證實ALS患者殘存神經元及膠質細胞內存在異常的蛋白聚集物——TDP-43免疫反應陽性包涵體，其在中樞神經系統中的播散可能是ALS的核心病理機制,但TDP-43免疫反應陽性包涵體在中樞神經系統中的播散方式仍不明。有學者[3]對20余例ALS患者尸檢病理結果研究后提出：TDP-43免疫反應陽性包涵體沿突觸順行及逆行方式在神經元及膠質細胞間播散或通過腦脊液播散是ALS的主要病理機制。隧道納米管(tunneling nanotubes, TNTs)是哺乳動物細胞間一種新型的通訊鏈接方式[4],主要負責細胞器的轉運，例如信號分子Ca2+、線粒體、細胞內小泡、高爾基體、內質網。近期研究[5-6]發現蛋白聚集體、朊蛋白等也可通過TNTs在細胞間轉運，TNTs可能為神經退行性疾病相關包涵體在中樞神經系統播散提供途徑。該研究通過建立腦脊液-細胞模型，觀察ALS患者腦脊液對人星形膠質細胞瘤細胞U251 TNTs形成的影響,探討ALS患者腦脊液促進相關致病包涵體播散的病理機制。

1對象與方法

1.1研究對象收集2014年6月至2015年6月在鄭州大學第一附屬醫院確診的散發性ALS患者16例，均經過詳細的神經科、神經影像、神經電生理及血液學檢查，診斷均符合1998年世界神經病學聯盟E1 Escorial診斷標準(修訂版),其中男11例，女5例，年齡39～53(46.0±5.3)歲。對照組為同期就診的功能性頭痛患者10例，其中男6例，女4例，年齡49～62(56.0±4.2)歲，無明顯神經系統癥狀、無神經系統炎性及退行性病變，神經系統體格檢查無異常。該研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，全部患者均簽署知情同意書。

1.2標本采集對受試者行腰椎穿刺術，采集腦脊液標本10～15 mL(棄去可視血性腦脊液)，并分裝至1.5 mL的聚丙烯管，置于-80 ℃液氮罐中保存。

1.4TNTs的形成檢測采用細胞免疫熒光化學技術。在37 ℃避光條件下，使用 Alexa Fluor 488 Phalloidin(瑞士Invitrogen 公司)分子探針對TNTs進行標記。在室溫條件下將細胞用40 g/L的多聚甲醛固定10 min，用PBS漂洗，加入體積分數0.25% Triton X-100靜置15 min，用100 g/L的牛血清白蛋白封閉1 h，加入Alexa Fluor 488 Phalloidin室溫下孵育1 h。使用熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)觀察Alexa Fluor 488 Phalloidin(綠色熒光)標記的TNTs的形成，高倍鏡下拍攝照片，用Image-Pro Plus 7.0圖像分析軟件測定表達TNTs的U251細胞百分比。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。不同培養條件及培養不同時間對表達TNTs結構的U251細胞百分比的影響采用2×5析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1U251細胞培養后TNTs的形成結果見圖1。由圖1可見ALS-CSF培養的U251細胞間存在典型的TNTs結構連接(箭頭所示)。

2.2兩組U251細胞中表達TNTs的U251細胞百分比的比較見表1。由表1可知，ALS-CSF組表達TNTs結構的U251細胞百分比高于NC-CSF組。ALS-CSF組表達TNTs結構的U251細胞百分比先上升，到7 d時達到高峰，隨后逐漸下降。

圖1　U251細胞經ALS-CSF培養后TNTs的形成(×400)

%

F組別=29 073.984，P<0.001；F時間=3 311.226，P<0.001；F交互=2 267.715，P<0.001。

2.3ALS-CSF組F-actin蛋白的表達結果見圖2。由圖2可見，培養3 d時U251細胞中F-actin蛋白表達量升高，7 d時最高，10 d時開始減少。

圖2　Western blot檢測ALS-CSF組F-actin蛋白的表達

3討論

ALS是一種進行性神經系統變性疾病。目前醫學領域對該病的病因、發病機制認識尚不明確，尚無有效治療方法[7]，患者最終多死于呼吸肌麻痹或并發呼吸道感染。

近年來，研究[3]表明ALS的病程進展與TDP-43免疫反應陽性包涵體在中樞神經系統的播散密切相關。研究[8-10]表明ALS患者腦脊液中TDP-43蛋白的含量增加，使用ALS患者腦脊液培養神經細胞可對神經細胞產生損害。ALS-CSF可能為TDP-43免疫反應陽性包涵體在中樞神經系統的播散提供了載體，但TDP-43免疫反應陽性包涵體在神經元及膠質細胞間的轉運方式仍不明確。

TNTs又稱膜納米管，是一種新發現的細胞間通訊途徑。2004年，Rustom等[11]在大鼠嗜鉻細胞瘤細胞中首次發現一種奇特的納米級纖細長管，又用多組實驗證明了這是一種新型的細胞連接方式，并將其命名為TNTs。隨后人們陸續在免疫細胞、腫瘤細胞、內皮細胞等細胞中發現這種物理性質的連接，表明TNTs作為細胞間相互交流的通道在動物細胞中普遍存在[12-13]。TNTs是由表層的細胞膜和內部的細胞骨架構成，一直處于形成和斷裂的持續變化狀態之中；作為貫穿其中的特征性結構，絲狀肌動蛋白F-actin不僅調節著TNTs的長度變化，同時在相連接的細胞間形成了復雜的通信網絡，介導了細胞間的物質運輸和信號交流，從而在多種生理過程中發揮著重要的作用[14]。目前研究[15-16]發現誘導TNTs形成的機制包括：Rho GTPase、Fas、P53/AKT/PI3K、M-sec/Ral/exocyst信號通路的激活；而化學刺激、機械力以及長時間的光照能夠引起TNTs的斷裂，抑制微絲形成的藥物Latrunculin B 和Cytocalasin D也能夠抑制TNTs的形成。TNTs主要負責細胞器的轉運，例如信號分子Ca2+、線粒體、細胞內小泡、高爾基體等。隨后的研究[6，17]顯示多種蛋白聚集體、病毒等可通過TNTs在神經細胞間傳遞。TNTs可能為神經退行性疾病相關包涵體在中樞神經系統的播散提供了高效的細胞間通道。

該研究使用ALS-CSF培養U251細胞建立腦脊液-細胞模型，結果發現在ALS-CSF培養條件下,表達TNTs結構的U251細胞百分比較NC-CSF組增加，ALS-CSF培養的U251細胞中表達TNTs的U251細胞百分比和F-actin表達量均在3 d時升高，7 d時表達量最高，10 d時開始減少。以上結果表明ALS-CSF培養的U251細胞在早期可誘導TNTs的形成。TNTs可能是ALS相關致病蛋白在中樞神經系統傳播的途徑，抑制TNTs的形成、阻斷神經細胞間的信息傳遞可能對防止神經元的退行性病變或損傷、延緩或阻止ALS病情的發展有重要意義。

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(2015-10-15收稿責任編輯徐春燕)

Effects of cerebrospinal fluid from patients with amyotrophic lateral sclerosis on generation of tunneling nanotubes-like structure in U251 cells

LIANGDongxiao1)，WANGXuejing1,2)，DINGXuebing1,2),HEYixin1)，PANPengwei1)，LIUDandan1)，TENGJunfang1,2)

1)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

Key wordsamyotrophic lateral sclerosis;cerebrospinal fluid;U251 cell;tunneling nanotube

AbstractAim: To investigate the effects of cerebrospinal fluid from patients with amyotrophic lateral sclerosis(ALS-CSF) on the generation of tunneling nanotubes(TNTs)-like structure in the human glioma U251 cells.Methods: CSF was collected from 16 ALS patients and 10 persons with functional headache(control) and used to culture U251 cells for 0，3，7，10，14 days,respectively. The generation of TNTs was observed under fluorescence microscope, and the percentage of U251 cells with TNTs among U251 cells was recorded. Then Western blot was used to detect the expression of F-actin in U251 cells cultured with ALS-CSF for 0，3，7，10，and 14 days.Results: The percentage of U251 cells with TNTs among U251 cells cultured with ALS-CSF was higher than control, which started to increase at day 3, and reached the peak at day 7, then gradually decreased from day 10. The expression of F-actin in U251 cells cultured with ALS-CSF had the same trend.Conclusion: ALS-CSF could induce the generation of TNTs-like structure in U251 cells,and the ALS-related pathogenic protein may propagate through TNTs-like structure in central nervous system of patients with ALS.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.006

#通信作者，男，1960年11月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:神經退行性疾病，E-mail:13838210077@163.com

中圖分類號R741.02

*國家自然科學基金資助項目81471307，81301086，81100881，81100949；鄭州市科技領軍人才項目13IPLJRC675