Nrf2對肝纖維化過程中炎癥細胞的影響

王維昊，林　森，王洪波，王紅娟，許偉華

山東大學第二醫院消化內科 濟南 250033

Nrf2對肝纖維化過程中炎癥細胞的影響

王維昊，林森，王洪波，王紅娟，許偉華#

山東大學第二醫院消化內科 濟南 250033

關鍵詞核因子相關因子2；中性粒細胞；巨噬細胞；肝纖維化；小鼠

摘要目的：探索在四氯化碳誘導小鼠肝纖維化形成過程中，核因子相關因子2(Nrf2)對炎癥細胞浸潤的影響。方法：野生鼠和Nrf2基因敲除鼠各24只，分別隨機平均分成對照組和模型組。HE染色、Masson三色染色觀察肝組織病理學變化及肝臟纖維化程度；天狼星紅染色觀察膠原沉積情況；免疫組化方法檢測肝組織中中性粒細胞浸潤(Ly6-G陽性)情況；免疫熒光方法檢測巨噬細胞浸潤及活化(ER-MP23陽性)情況。結果：兩個對照組均未有肝纖維化表現；基因敲除模型組小鼠肝組織壞死及纖維化程度重于野生模型組，膠原含量更多(P<0.05)。四氯化碳誘導可增強肝組織中中性粒細胞的浸潤，但基因敲除鼠中性粒細胞浸潤輕于野生模型鼠(P<0.05)。Nrf2基因敲除和四氯化碳誘導均增強肝組織中巨噬細胞的活化，兩者具有協同效應(P<0.05)。結論：Nrf2可以通過抑制巨噬細胞活化抑制四氯化碳誘導的肝纖維化發展。

肝纖維化是絕大部分慢性肝病發展到肝硬化的必經過程，其發生機制主要是肝臟損傷因素持續存在(如酒精、病毒、藥物等)，引起肝細胞變性壞死、炎癥細胞浸潤，繼而使肝內纖維結締組織異常增生。各種原因導致的肝纖維化病程進展中都伴有不同程度的氧化應激，持續的氧化應激可以加重肝細胞損傷、促進炎癥介質及細胞因子的釋放、促進肝星狀細胞的活化，加速肝纖維化的進程[1]。核因子相關因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)是抗氧化應激的關鍵分子，當細胞受到氧化應激損傷時，Nrf2表達上調，促進抗氧化基因的表達，減少細胞損傷[2]。前期研究[3]顯示，在四氯化碳誘導的急性肝損傷中，相比野生鼠，Nrf2基因敲除鼠肝組織中IL-1α、TNF-α、IFN-α等炎癥介質分泌增多，中性粒細胞浸潤增多且持續時間延長。在此基礎上，作者觀察了四氯化碳誘導的慢性肝纖維化形成過程中，Nrf2對中性粒細胞浸潤和巨噬細胞激活的影響，報道如下。

1材料與方法

1.1動物小鼠均由瑞士ETH大學細胞生物學院提供，飼養于SPF條件下，體重(20±5) g，野生鼠和Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)鼠各24只。

1.2藥物和試劑四氯化碳購自國藥集團化學試劑有限公司，用礦物油稀釋至60%。Ly6-G抗體購于瑞士BD Pharmingen公司，ER-MP23購于Abcam公司，二抗購于美國Jackson ImmunoResearch實驗室，ABC試劑盒購于加拿大Vector實驗室。

1.3實驗分組實驗分4組：野生對照組、Nrf2-/-對照組、野生模型組、Nrf2-/-模型組，每組12只。模型組給予礦物油稀釋的四氯化碳腹腔注射，每3 d注射1次，每次0.5 mL/kg，共注射15次，最后一次注射3 d后處死小鼠；對照組僅給予相同劑量的礦物油腹腔注射，其他操作同模型組。

1.4肝組織損傷程度及纖維化程度評價處死小鼠后，取小鼠肝臟，一部分置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，常規方法制備3.5 μm厚石蠟切片，分別進行HE染色、Masson三色染色和天狼星紅染色，顯微鏡下觀察并拍照。HE、Masson染色用于觀察肝細胞壞死情況、炎癥細胞浸潤程度、纖維組織增生程度、小葉結構是否紊亂；天狼星紅染色用于觀察膠原沉積情況。每張切片選取5個不重復視野觀察，Masson染色以藍色信號為陽性，天狼星紅染色以紅色信號為陽性。用IPP軟件進行定量分析，計算陽性信號面積與視野內肝組織總面積之比，取平均值。

1.5肝組織中中性粒細胞浸潤和巨噬細胞激活的檢測取另一部分肝臟置于體積分數95%的酸性乙醇中固定，常規方法制備3.5 μm厚石蠟切片，浸入用30 g/L牛血清白蛋白、pH為7.4的PBST稀釋的Ly6-G抗體和ER-MP23抗體中4 ℃過夜，PBST搖洗3次，每次5 min，后滴加稀釋好的二抗，細胞核用Hoechst復染，37 ℃恒溫30 min后，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察并拍照。用IPP軟件定量分析：每張片子選取5個不重復視野，計數每個視野(×20)的陽性細胞數，取平均值。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析，兩樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1肝組織病理學變化HE染色結果見圖1。野生對照組和Nrf2-/-對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝組織正常，未見明顯肝細胞變性壞死。野生模型組小鼠可見大量肝細胞脂肪變性，中央靜脈及匯管區大量炎癥細胞浸潤，并出現深染的纖維結締組織；Nrf2-/-模型組小鼠肝細胞變性壞死較野生模型組更加明顯，肝板結構消失，彌漫性炎癥細胞浸潤，有明顯纖維間隔形成。Masson三色染色結果(圖2、表1)顯示：對照組小鼠均不存在肝纖維化，Nrf2-/-模型組肝纖維化面積較野生模型組明顯增大。天狼星紅染色(圖3、表1)結果顯示；對照組小鼠均不存在肝組織膠原沉積，Nrf2-/-模型組肝組織中膠原沉積較野生模型組明顯增多。

A:野生對照組；B:Nrf2-/-對照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖1　4組肝組織HE染色結果(×20)

A:野生對照組；B:Nrf2-/-對照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖2　4組肝組織Masson三色染色結果(×20)

A:野生對照組；B:Nrf2-/-對照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖3　4組肝組織天狼星紅染色結果(×20)

%

2.2中性粒細胞浸潤和巨噬細胞激活情況見圖4、圖5和表2、表3。

A:野生對照組；B:Nrf2-/-對照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖4　4組Ly6-G(中性粒細胞浸潤)免疫組化染色結果(×20)

A:野生對照組；B:Nrf2-/-對照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖5　4組ER-MP23(巨噬細胞激活)免疫熒光染色結果(×20)

表24組肝中性粒細胞浸潤比較(n=12)陽性細胞/mm2

模型Nrf2-+-70.839±31.88363.275±24.257+69.407±26.125127.499±42.411

F模型=11.579，P=0.001；FNrf2=7.498，P=0.009；F交互=12.660，P=0.001。

表34組肝巨噬細胞激活比較(n=12)陽性細胞/mm2

模型Nrf2-+-59.118±27.49846.944±28.326+196.083±35.04096.150±25.731

F模型=120.473，FNrf2=43.804，F交互=26.755，P均<0.001。

3討論

肝纖維化是肝臟受損后的一種積極的自我修復過程。無論是何種原因導致的肝纖維化，都伴隨著慢性炎癥的刺激，肝臟炎癥反應和肝纖維化密切相關[4]。這種炎癥反應主要表現為炎癥介質的釋放和炎癥細胞的浸潤[5]。肝纖維化不斷進展的一個重要的影響因素就是氧化應激，氧化應激的積累可以引起蛋白質變性和DNA損傷，加重肝細胞的壞死和凋亡，還能促進炎癥介質和細胞因子的釋放，加重其介導的炎癥反應。Nrf2作為體內的抗氧化反應的關鍵靶點，可保護組織細胞免受氧化應激的損傷，同時也具有一定的抗炎作用[6]。Nrf2可以通過上調抗氧化基因表達、抑制TGF-β等細胞因子釋放、促進膠原降解等多途徑抑制肝纖維化的快速進展[7]。該研究結果顯示，與野生鼠比較，四氯化碳誘導的Nrf2-/-小鼠肝細胞壞死和膠原沉積程度更嚴重，表現出更嚴重的纖維化，證實Nrf2在肝纖維化進程中發揮了抑制作用。

在肝纖維化過程中伴隨著中性粒細胞的浸潤增多，而且中性粒細胞浸潤在一定程度上對肝纖維化有促進作用[8-9]。但Saito等[10]的研究顯示，在膽總管結扎導致的肝纖維化過程中，減少中性粒細胞或使其功能缺失并不能顯著改善肝纖維化的程度，也就是說雖然中性粒細胞已被證實可以促進肝纖維化的進程，但是其在肝纖維化形成中的作用并非關鍵。該研究結果顯示，經四氯化碳誘導，野生小鼠肝組織中中性粒細胞浸潤增強(Ly6-G陽性細胞數量增加)；與野生鼠相比，Nrf2-/-鼠中性粒細胞浸潤減少，但是肝纖維化程度卻明顯加重。之前研究[3]顯示，在四氯化碳所致的急性肝損傷時，Nrf2敲除鼠中性粒細胞浸潤較野生鼠更明顯，說明急性肝損傷中Nrf2可以在一定程度上抑制中性粒細胞浸潤。這種在急性肝損傷和慢性肝纖維化中，Nrf2對中性粒細胞浸潤的兩種截然不同的影響，其原因還有待進一步探索。畢竟，肝纖維化時中性粒細胞浸潤是個復雜的細胞跨膜遷移過程，不僅需要炎癥介質的吸引，還需要一些其他信號分子共同作用使中性粒細胞滲出[11]，即使在敲除Nrf2后炎癥介質釋放增加，也可能通過影響其他信號分子使中性粒細胞浸潤減少，但具體機制還需進一步研究。總之，在四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化過程中，肝內中性粒細胞浸潤在一定程度上需要依賴Nrf2的參與。

肝臟的巨噬細胞是庫普弗細胞，在肝臟受到損傷時活化，主要通過釋放細胞因子(如TGF-β、TNF-α等)刺激肝星狀細胞分泌細胞外基質，促進肝纖維化進展[12]。在肝纖維化進展階段，敲除巨噬細胞可以有效抑制肝纖維化進展[13]。然而，巨噬細胞也可以吞噬壞死的肝細胞和增生的膠原，在肝纖維化恢復階段發揮積極的作用。有研究[14-15]顯示，在肝纖維化恢復階段，敲除巨噬細胞可以導致細胞外基質的持續積累，延緩肝臟的修復再生。這是由于在肝纖維化形成和修復階段，巨噬細胞表型不同而發揮的作用不同所致。該研究結果顯示，在肝纖維化形成過程中，Nrf2敲除鼠相比野生鼠肝內ER-MP23陽性細胞明顯增多，Nrf2敲除促進了巨噬細胞的浸潤，提示Nrf2可能通過抑制肝內巨噬細胞的活化而發揮抗纖維化的作用。

綜上所述，Nrf2作為體內關鍵的抗氧化應激分子，可以抑制四氯化碳所致的肝纖維化進程，這種抑制作用可以通過抑制肝內巨噬細胞的活化而實現。在四氯化碳所致的肝纖維化中，Nrf2反而加重了中性粒細胞的浸潤，這可能是Nrf2在對抗肝纖維化的積極作用中的一個不利因素，其具體機制還需進一步證實和研究。

致謝：感謝瑞士蘇黎世 ETH生物學院Sabine Werner教授提供的實驗條件，感謝Tobias A Beyer博士提供的實驗指導。

參考文獻

[2]YANG JJ,TAO H,HUANG C,et al.Nuclear erythroid 2-related factor 2: a novel potential therapeutic target for liver fibrosis[J].Food Chem Toxicol,2013,59:421

[3]XU W,HELLERBRAND C,K?HLER UA,et al.The Nrf2 transcription factor protects from toxin-induced liver injury and fibrosis[J].Lab Invest,2008,88(10):1068

[4]NOVO E,CANNITO S,PATERNOSTRO C,et al.Cellular and molecular mechanisms in liver fibrogenesis[J].Arch Biochem Biophys,2014,548:20

[5]KERSHENOBICH STALNIKOWITZ D,WEISSBROD AB.Liver fibrosis and inflammation：a review[J].Ann Hepatol,2004,2(4):159

[6]葉鳴,胡容.Nrf2在炎癥相關疾病中的保護作用[J].藥物生物技術,2013,20(4):353

[7]MEAKIN PJ,CHOWDHRY S,SHARMA RS,et al.Susceptibility of Nrf2-null mice to steatohepatitis and cirrhosis upon consumption of a high-fat diet is associated with oxidative stress, perturbation of the unfolded protein response, and disturbance in the expression of metabolic enzymes but not with insulin resistance[J].Mol Cell Biol,2014,34(17):3305

[8]PENTEADO FC,FERREIRA HH,CALAFATTI SC,et al.Neutrophil migration during liver cirrhosis in rabbits[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2002,29(4):285

[9]MCDONALD B,PITTMAN K,MENEZES GB,et al.Intravascular Danger Signals Guide Neutrophils to Sites of Sterile Inflammation[J].Science,2010,330(62):362

[10]SAITO JM,BOSTICK MK,CAMPE CB,et al.Infiltrating neutrophils in bile duct-ligated livers do not promote hepatic fibrosis[J].Hepatol Res,2003,25(2):180

[11]謝晶日,張永,王海強.中性粒細胞跨膜遷移在酒精性脂肪性肝病發病機制中的研究[J].中西醫結合肝病雜志,2012,22(1):64

[12]MELINO M,GADD VL,WALKER GV,et al.Macrophage secretory products induce an inflammatory phenotype in hepatocytes[J].World J Gastroenterol,2012,18(15):1732

[14]DUFFIELD JS,FORBES SJ,CONSTANDINOU CM,et al.Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair[J].J Clin Invest,2005,115(1):56

[15]陳芳艷,賀福初,姜穎.肝纖維化發生發展及逆轉過程中肝巨噬細胞亞群分類[J].中國生物化學與分子生物學報,2012,28(10):879

Effects of nuclear factor-E2 related factor 2 on inflammatory cells during liver fibrosis

WANGWeihao,LINSen,WANGHongbo,WANGHongjuan,XUWeihua

DepartmentofGastroenterology,theSecondHospital，ShandongUniversity,Jinan250033

Key wordsNrf2;neutrophil;macrophage;liver fibrosis;mouse

AbstractAim: To investigate the effects of nuclear factor-E2 related factor 2(Nrf2) on infiltration of inflammatory cells from rats with CCl4-induced liver fibrosis. Methods: There were four groups including wild type(WT) control group(WT mice without CCl4-induction), WT-CCl4 group(WT mice with CCl4-induction), Nrf2 knockout(Nrf2-/-) control group(Nrf2-/-mice without CCl4-induction) and Nrf2-/--CCl4 group(Nrf2-/-mice with CCl4-induction), and 12 in each group. Histological morphology was studied by HE staining,Masson triple staining, and Sirius red staining was used to observe the deposition of collagen.Neutrophils(labelled by Ly6-G ) and macrophages(labelled by ER-MP23) infiltration were detected by immunohistochemical staining and immunofluorescence,respectively. Results: The two control groups had no liver fibrosis pathogenic manifestations; the liver fibrosis was more severe and collagen content was higher in Nrf2-/--CCl4 group than those in WT-CCl4 group(P<0.05).In the WT-CCl4 group,the infiltration of neutrophils were increased obviously compared with control groups,but there was a significant decrease in the Nrf2-/--CCl4 group when compared with the WT-CCl4 group(P<0.05).The macrophages were infiltrated and activated in the model groups than in the control groups,especially in the Nrf2-/--CCl4 group(P<0.05).Conclusion: Nrf2 plays a protective role in CCl4-induced liver fibrosis via inhibiting the activation of macrophages.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.013

#通信作者，女，1967年4月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：慢性肝病、肝纖維化，E-mail：wwh60068@163.com

中圖分類號R575.2