結核分枝桿菌Rv1242蛋白抗原表位的預測>*

侯　英，白雪娟，梁　艷，吳雪瓊#

1)北京衛生職業學院醫學技術系 北京 100053　2)中國人民解放軍第309醫院全軍結核病研究所；全軍結核病防治重點實驗室；結核病診療新技術北京市重點實驗室 北京 100091#通信作者，女，1963年7月生，博士，研究員，研究方向：新型疫苗、診斷技術和新藥的研究，E-mail:wu-xueqiong@263.net

結核分枝桿菌Rv1242蛋白抗原表位的預測>*

侯英1,2)，白雪娟2)，梁艷2)，吳雪瓊2)#

1)北京衛生職業學院醫學技術系 北京 1000532)中國人民解放軍第309醫院全軍結核病研究所；全軍結核病防治重點實驗室；結核病診療新技術北京市重點實驗室 北京 100091#通信作者，女，1963年7月生，博士，研究員，研究方向：新型疫苗、診斷技術和新藥的研究，E-mail:wu-xueqiong@263.net

關鍵詞抗原表位；Rv1242蛋白；二級結構；結核分枝桿菌

摘要目的：預測結核分枝桿菌Rv1242蛋白的抗原表位。方法：利用DNAStar軟件包中Protean軟件對Rv1242氨基酸序列進行分析，采用包括二級結構、親水性、抗原性、表面可能性、柔韌性等多參數預測其二級結構及T細胞和B細胞抗原表位。結果：Rv1242蛋白具有豐富的二級結構和多處抗原指數較高的區段，有7個親水性區域，含有B細胞抗原肽表位(可能在17-38、72-82、84-90、116-130、134-143位氨基酸殘基或其附近)，這些表位抗原性較好，都含有β轉角和不規則卷曲結構，表面可能性和柔韌性都較大。該蛋白還含有T細胞抗原肽表位(可能在24-33、42-59、68-77、90-108位氨基酸殘基或其附近)。結論：Rv1242蛋白可能是一個既有T細胞抗原表位、也有B細胞抗原表位的抗原，該研究為進一步研究該蛋白抗原表位及其應用奠定了基礎。

目前，結核分枝桿菌感染后如何與宿主相互作用尚不十分清楚。結核分枝桿菌抗原能夠刺激機體產生免疫應答，并能與免疫應答產物如抗體和致敏淋巴細胞在體外結合，激發免疫效應。宿主免疫細胞通過其表面受體識別的并不是整個蛋白質抗原分子，而是抗原肽分子中由特殊的化學基團組成的結構即抗原決定簇，又稱為表位。蛋白抗原不僅含有B細胞、T細胞[Th細胞與CD8+細胞毒性T 淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)]、NK細胞等與免疫識別、免疫應答密切相關的表位結構，也含有一些對于保護性免疫不利的表位結構。因此，抗原優勢表位的篩選和鑒定對表位疫苗的研制具有重要意義。結核分枝桿菌蛋白抗原表位的免疫學特性成為當前研究的熱點之一。結核分枝桿菌 rv1242基因(vapC33)全長432 bp，并非結核分枝桿菌 H37Rv體外生長所必需；編碼一個含143個氨基酸的跨膜蛋白，等電點5.892 1，預測相對分子質量為15 873.1，在培養濾液中檢測不到；其作用尚不十分清楚，可能是一種含PIN結構域的vapC33毒素，在宿主-病原體相互作用中發揮重要作用[1-2]。結核分枝桿菌Rv1242蛋白(簡稱Rv1242蛋白)是一個膜蛋白，而膜蛋白通常參與結核分枝桿菌重要的生物代謝、合成過程和誘導宿主的免疫應答。目前對該蛋白的研究報道很少，對其免疫學特性不是很清楚。因此，該研究首次釆用生物信息學軟件DNAStar對Rv1242蛋白進行抗原表位預測，為今后進一步深入研究和應用尤其是疫苗和免疫診斷試劑的開發奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料抗原表位分析軟件：使用DNAStar生物軟件包對DNA和蛋白質進行分析，并用其中的Protean軟件分析和預測蛋白的二級結構和抗原表位[3]。Rv1242蛋白氨基酸全序列見GenBank(http://www.tbdb.org/)，NP編號215758.1(143個氨基酸殘基)。

1.2Rv1242蛋白二級結構的預測Rv1242蛋白二級結構采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Coiled Coil方法預測。

1.3Rv1242蛋白抗原表位的預測使用Kyte-Doolittle方法、Hopp-Woods方法和Eisenberg方法預測Rv1242蛋白的疏水性和親水性，Emini方法預測表面可能性；Karplus-Schulz方法預測蛋白質骨架區的柔韌性，AMPHI方法預測蛋白免疫優勢輔助性T淋巴細胞抗原位點，Jameson-wolf方法預測蛋白潛在的抗原表位，Rothbard-Taylor方法預測含有特定基序(motif)的潛在T淋巴細胞抗原表位，Sette MHC Motifs預測短肽上與小鼠MHC Ⅱ d型蛋白質相互作用的抗原位點；最終對Rv1242蛋白的抗原表位給出綜合評價。

2結果

2.1Rv1242蛋白二級結構預測結果見圖1。對Rv1242蛋白二級結構的預測結果顯示α螺旋結構形成在22-29、50-54、62-75、86-96、92-102、108-114、116-124、126-138、140-143位氨基酸殘基，數量較多，不存在跨膜區的α螺旋結構；β折疊分布較均勻(位于1-17、34-60、68-72、79-84、88-91、103-117位氨基酸殘基)。該蛋白在各β折疊單元之間于18-23、25-26、30-33、73、76-79、85-88、97-100、124-125、127、136-137、139-142存在較多的轉角；在18-21、24、30-32、34、61、74-77、85、125、138-140位氨基酸殘基存在無規則卷曲。

圖1　Rv1242蛋白二級結構和抗原表位預測

2.2Rv1242蛋白的親水性和疏水性預測結果顯示：Rv1242蛋白存在7個親水性區域(位于17-38、72-77、86、88、100-102、106-130、134-143位氨基酸殘基)和7個疏水性區域(位于1-16、39-68、70-71、80-83、89、99、108-115位氨基酸殘基)。

2.3Rv1242蛋白表面可能性和柔韌性預測Rv1242蛋白表面可能性較大的區域主要是在17-23、73-75、118-120、125-128、136-143位氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現為負值。

Rv1242蛋白含有較多的柔韌性區域(位于5、16-21、30-36、62-64、74-78、84-87、97-102、106-108、124-128、137-140位氨基酸殘基)，且均勻分布。

2.4Rv1242蛋白T細胞和B細胞抗原肽表位的預測綜合二級結構、抗原性、親水性、表面可能性和柔韌性分析結果，推測Rv1242蛋白潛在的B細胞抗原表位在17-38、72-82、84-90、116-130、134-143位氨基酸殘基或其附近。

潛在的T細胞抗原表位在24-33、42-59、68-77、90-108位氨基酸殘基或其附近，可能是免疫優勢的輔助性 T 淋巴細胞抗原位點。10-15、20-24、39-44、48-59、79-84、102-107、122-127位氨基酸殘基可能是與小鼠 MHC Ⅱ d 型蛋白質相互作用的抗原位點。

3討論

結核分枝桿菌生長緩慢，天然蛋白抗原的獲取較困難，通過基因工程技術獲得重組蛋白抗原進行研究應用已成為一個簡便、有效的途徑。此外，近年來結核疫苗如重組蛋白疫苗、重組卡介苗、DNA疫苗的研發[4]，有些已經進入臨床試驗，而生物信息技術的迅猛發展和互聯網數據庫的開發利用已為確定優勢抗原表位提供了有效的方法。根據生物信息學軟件的預測結果選擇合成不同的多肽進行針對性的篩選、評價，可以顯著降低候選肽段的數目，減少合成肽段的費用和體外實驗鑒定的工作量，同時也縮短了時間，避免遺漏一些較長的表位。利用具有強大功能的生物信息學軟件進行表位預測將為表位疫苗的發展、免疫診斷制劑的開發開辟新的路徑[5]。

DNAStar軟件包中Protean軟件已被用于蛋白抗原表位的預測[6-7]。該研究應用Protean軟件對Rv1242氨基酸序列進行分析，結果顯示該蛋白同時含有B細胞抗原肽表位和T細胞抗原肽表位。B細胞表位絕大部分(約90%)是構象型表位[8]，而DNAStar軟件是在氨基酸一級結構的基礎上應用多個參數預測B細胞抗原表位，如轉角、折疊、卷曲、親水性、抗原性、表面可能性、柔韌性等，忽略各氨基酸之間的分子作用力，因此，對構象型的B細胞表位的預測有一定局限性。可通過Western blot和ELISA分析其抗原抗體反應親和力等實驗鑒定細胞表位。

T細胞表位都是線性表位[8]，但該研究預測的T細胞表位氨基酸殘基42-59與McMurry等[9]鑒定細胞表位基本一致，而該研究預測到24-33、68-77、90-108這3段未得到證實，可能是因為DNAStar軟件用于預測T細胞表位的參數較少，用生物信息學方法只能預測理論優勢表位，不能完全反映機體免疫反應的真實情況，可以通過T 細胞增殖性實驗、細胞殺傷實驗、流式細胞術、ELISPOT技術等鑒定。鑒于抗結核免疫主要是細胞免疫，此次研究預測的T細胞表位可能在抗結核感染的保護性免疫應答中發揮重要和獨特的作用。

總之，生物信息學分析顯示Rv1242可能是一個既有T細胞抗原表位，也存在B細胞抗原表位的蛋白抗原。該研究結果為進一步深入研究該抗原可否成為疫苗組分之一或細胞免疫刺激原奠定了理論基礎。

參考文獻

[1]DE SOUZA GA, LEVERSEN NA, MALEN H.Bacterial proteins with cleaved or uncleaved signal peptides of the general secretory pathway[J].J Proteomics,2011,75(2):502

[2]HIWA M?LEN,TINAS?FTELAND,TINAS?FTELAND,et al.Definition of novel cell envelope associated proteins in Triton X-114 extracts of Mycobacterium tuberculosis H37Rv[J].BMC Microbiol,2010,10:132

[3]朱育菁,劉波,鄭偉文,等.基因序列蛋白質結構分析軟件Protean使用技術[J].福建農業生物技術通訊,2004,6(4):8

[4]吳雪瓊.新型結核病疫苗的研究現狀與發展趨勢[J].中國防癆雜志,2012,34(3):133

[5]李松,王英.生物信息學在生命科學研究中的應用[J].熱帶醫學雜志,2009,9(10):1218

[6]黎明,于天飛.DNAStar軟件在動物病毒研究中的應用實例[J].高師理科學刊,2010,30(3):61

[7]白雪娟,趙亞靜,梁艷,等.結核潛伏感染蛋白Rv1737c B細胞、CTL及Th表位預測與分析[J].實用臨床醫藥雜志,2015,19(3):5

[8]李海俠,毛旭虎.蛋白質抗原表位研究進展[J].微生物學免疫學進展,2007,35(1):54

[9]MCMURRY J,SBAI H,GENNARO ML,et al.Analyzing Mycobacterium tuberculosis proteomes for candidate vaccine epitopes[J].Tuberculosis(Edinb),2005,85(1/2):95

(2015-08-19收稿責任編輯徐春燕)

Prediction of epitopes ofMycobacteriumtuberculosisRv1242 protein

HOUYing1,2)，BAIXuejuan2)，LIANGYan2)，WUXueqiong2)

1)DepartmentofMedicalTechnology,BeijingHealthVocationalCollege，Beijing1000532)InstituteforTuberculosisResearch,the309thHospitalofChinesePLA;ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory;BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,Beijing100091

Key wordsepitope;Rv1242 protein;secondary structure;Mycobacterium tuberculosis

AbstractAim: To predict the epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv1242 protein. Methods: The amino acid sequence of Rv1242 protein was input and B cell and T cell epitopes were predicted using multi-parameters such as hydrophilicity,antigenicity,accessibility,flexibility,as well as the secondary structure by Protean software of DNAStar software package.Results: Rv1242 protein had rich secondary structure and multiple sections with higher antigenicity. There were 7 hydrophilic regions. There were potential B cell epitopes at 17-38，72-82，84-90，116-130，134-143 amino acid residues or nearby. These epitopes had better antigenicity, contained beta angle and irregular coil structure, and presented in the surface with larger probability and flexibility. There were also potential T cell epitopes at 24-33，42-59，68-77，90-108 amino acid residues or nearby. Conclusion: Mycobacterium tuberculosis Rv1242 is probably a protein antigen with both T and B cell epitopes, which will lay the foundation for its further study and application.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.015

中圖分類號R52

*國家重大傳染病防治科技重大專項基金資助項目2012ZX10003008002；軍隊醫學科技“十二·五”重點項目BWS11J050；北京市科技創新基地培育與發展工程專項Z141107004414021；北京高等學校青年英才計劃項目YETP1999