HDAC2 siRNA轉染對卵巢癌ovcar3細胞中p53和乙酰化p53k320表達的影響>*

張　敏，趙書君，朱　海，胡曉靜，余亞南，韓會會，曹　蒙，李紅雨

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052

HDAC2 siRNA轉染對卵巢癌ovcar3細胞中p53和乙酰化p53k320表達的影響>*

張敏，趙書君，朱海，胡曉靜，余亞南，韓會會，曹蒙，李紅雨#

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052

關鍵詞組蛋白去乙酰化酶2；p53；乙酰化p53k320；ovcar3細胞株；卵巢腫瘤

摘要目的：探討靶向沉默組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)對人卵巢癌ovcar3細胞中p53乙酰化位點k320表達的影響。方法：將ovcar3細胞隨機分為空白組、對照組和實驗組3組，實驗組以HDAC2 siRNA轉染細胞，對照組轉染對照siRNA，空白組不處理，分別采用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測3組細胞中HDAC2 mRNA和蛋白的表達，Western blot 檢測3組細胞中p53、乙酰化p53k320蛋白的表達。結果：與空白組及對照組相比，實驗組HDAC2 mRNA和蛋白的表達降低(P<0.05)，p53蛋白和乙酰化p53k320蛋白表達均升高(P<0.05)。結論：下調HDAC2的表達可使p53和乙酰化p53k320表達增加。

卵巢上皮性癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，其病死率位居第1，由于起病比較隱匿，臨床缺乏早期診斷方法，大約70% 以上的卵巢上皮性癌患者就診時已屬晚期，其5 a 生存率僅30%～40%[1-2]。目前發現表觀遺傳能夠調控腫瘤的發生發展，其涉及染色質層面，主要為核心組蛋白共價修飾(組蛋白修飾)[3]。組蛋白乙酰化狀態由組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)之間的活性競爭決定[4-5]。HDAC2作為組蛋白去乙酰化酶家族中的一員，廣泛參與基因的轉錄沉默[3]。組蛋白去乙酰化可引起抑癌基因如p53等的表達被抑制或過度激活，均可導致腫瘤的發生[6]。p53和HDAC2之間的關系密切，其活性可在轉錄和轉錄后水平被調控，例如乙酰化作用[7]。 p53功能被HDAC2通過泛素化依賴識別和伴隨p53在k320位點的脫乙酰化所拮抗[8]。k320位于p53與DNA連接的四聚化結構域，通過減少p53k320乙酰化引起的顯性負效應可能會損害p53四聚體結構域，從而影響p53與DNA的結合，影響靶基因的表達。作者擬采用RNA干擾技術，通過構建針對HDAC2基因的siRNA，特異性降低HDAC2的表達，觀察其對卵巢癌ovcar3細胞中p53k320表達的影響，為卵巢癌的治療提供新的靶點。

1材料與方法

1.1實驗試劑及儀器ovcar3細胞由鄭州大學第三附屬醫院科研中心保存。RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)購自以色列BI公司，逆轉錄及熒光定量檢測試劑盒購自中國南京諾唯贊生物科技有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，GAPDH、HDAC2、PCR引物及HDAC2 siRNA購自美國GeneCopoeia公司，HDAC2、p53、乙酰化p53k320抗體購自無錫藥科美生物科技有限公司。紫外可見光分光光度計為美國賽默飛世爾公司產品。

1.2細胞培養及分組用含體積分數10% FBS的RPMI 1640培養基于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養ovcar3細胞，48 h后傳代培養備用。轉染前1 d更換體積分數1% FBS培養基同步化處理細胞12 h，依次接種于新的直徑6 cm培養皿中，用含體積分數10% FBS的RPMI 1640培養基于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，待細胞均勻、完全貼壁生長后且細胞密度大于80%時用于轉染。待細胞50%～70%融合時，分為3 組，實驗組和對照組更換為新鮮配制的含 HDAC2 siRNA 或對照siRNA 的無抗生素、無血清培養基，空白組僅加入同種培養基。孵育6 h 后加入完全培養基，繼續培養18～24 h 后用于后續實驗。按照美國GeneCopoeia公司siRNA說明書進行操作，每組加入FBS、含有青霉素和鏈霉素的新鮮RPMI 1640培養基，用EndoFectin(美國GeneCopoeia公司)轉染試劑進行轉染，于37 ℃、體積分數5% CO2條件下轉染8～14 h，48 h后采用熒光顯微鏡觀察各組轉染后細胞形態學變化，判斷轉染效率。

1.3HDAC2 mRNA表達水平的實時熒光定量PCR檢測按Trizol試劑盒操作說明提取細胞總RNA。按試劑盒操作程序，逆轉錄制備cDNA后5倍稀釋，取1 μL進行PCR反應。按說明書配制PCR反應體系。PCR 反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，退火20 s，72 ℃延伸15 s，40 個循環；72 ℃終延伸5 min，立即進行熔解曲線分析。每組均設3個平行對照。

1.5統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組細胞中HDAC2 mRNA、蛋白及p53、乙酰化p53k320蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組卵巢癌ovcar3細胞中HDAC2 mRNA及蛋白的表達見圖1、表1。

圖1　3組卵巢癌ovcar3細胞中HDAC2蛋白的表達

組別nHDAC2mRNAHDAC2蛋白空白組31.035±0.1870.959±0.093對照組30.996±0.1520.921±0.105實驗組30.258±0.063*0.450±0.062*F92.186102.430P<0.001<0.001

*：與空白組和對照組相比，P<0.05。

2.23組卵巢癌ovcar3細胞中p53、乙酰化p53k320蛋白的表達見圖2、表2。

圖2　3組卵巢癌ovcar3細胞中p53及乙酰化p53k320蛋白的表達

表2　3組卵巢癌ovcar3

*：與空白組和對照組相比，P<0.05。

3討論

作者根據siRNA設計原則設計合成了針對HDAC2基因干擾位點的2條siRNA，經過沉默效率的比較，選用其中有意義的1條siRNA，用于轉染至ovcar3細胞后進行基因檢測。結果顯示，與對照組比較，siRNA能有效地阻抑HDAC2 mRNA的表達。

HDAC2為HDACs家族成員，HDACs可以移去N 端的乙酰基，減弱DNA 和組蛋白的相互作用而抑制轉錄[7]。有研究[9]證明，泛素化的HDAC2作用于乙酰化的p53k320可使后者去乙酰化，致使p53與DNA結合能力下降，從而影響靶基因的表達。因此作者采用沉默HDAC2基因，降低HDAC2的表達，觀察對乙酰化p53k320表達的影響。結果表明，沉默HDAC2基因可降低HDAC2 mRNA和蛋白的表達，使p53表達增加，乙酰化p53k320表達也增加。作者的研究不能肯定下調HDAC2的表達可上調p53k320的乙酰化水平，考慮可能還存在其他乙酰化途徑或非乙酰化途徑影響HDAC2對乙酰化p53k320的表達。

作者的研究結果從細胞分子水平證實HDAC2 的表達對ovcar3細胞中p53的表達具有調控作用，靶向沉默HDAC2 的表達可上調ovcar3細胞中p53的表達，提示其在卵巢癌的形成過程中起重要作用，并可能成為新的抗癌藥物的靶點。由于卵巢癌的發生發展因素多種多樣，目前只是進行初步研究HDAC2對ovcar3細胞中p53表達的影響，至于HDAC2對p53的影響途徑，后期將進一步研究。

參考文獻

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[2]姚俊閣,李紅雨,趙書君,等.卵巢上皮性癌組織中 SOX2和 CyclinD1的表達[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(2):247

[3]章慧,黃成,卞爾保,等.脂質體轉染HDAC2siRNA 對人肝癌細胞HepG2增殖的影響[J].中國藥理學通報,2013,29(10):1378

[4]李穎,王建東.卵巢癌表觀遺傳學調控研究進展[J].婦產與遺傳:電子版,2014,4(4):55

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[8]WAGNER T,KIWELER N,WOLFF K,et al.Sumoylation of HDAC2 promotes NF-κB-dependent gene expression[J].Oncotarget,2015,6(9):7123

[9]WAGNER T,BRAND P,HEINZEL T,et al.Histone deacetylase 2 controls p53 and is a critical factor in tumorigenesis[J].Biochim Biophys Acta,2014,1846(2):524

(2015-08-06收稿責任編輯趙秋民)

Effect of HDAC2 siRNA transfection on expression of p53 and acetylated p53k320 in ovarian cancer ovcar3 cells

ZHANGMin,ZHAOShujun,ZHUHai,HUXiaojing,YUYanan,HANHuihui,CAOMeng,LIHongyu

DepartmentofGynecologyandObstetrics，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordshistone deacetylase 2;p53;acetylated p53k320;ovcar3 cells line;ovarian neoplasm

AbstractAim: To investigate the effect of targeted silencing histone deacetylase 2(HDAC2) on expression of p53 and acetylation p53k320 in human ovarian cancer cell line ovcar3. Methods: ovcar3 cells were divided into 3 groups. HDAC2 siRNA was used to transfected into the ovcar3 cells in experimental group, and the cells transfected with control siRNA(control siRNA group) and the cells without treatment(control group) were the control. Real Time-PCR and Western blot was used to detect the expression of HDAC2 mRNA and protein; the expression of p53 and acethylased p53k320 were examined by Western blot.Results: Compared with control group and control siRNA group,the expressions of HDAC2 mRNA and protein in experimental group were decreased(P<0.05), and the expressions of p53 and acethylased p53k320 protein were increased(P<0.05).Conclusion: Downregulating the expression of HDAC2 could increase the expressions of p53 and acethylased p53k320.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.022

#通信作者，女，1964年9月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：lihongyu99@qq.com

中圖分類號R737.31

*鄭州市科學技術局2015普通科研項目153PKJGG165