卵泡液中游離DNA含量與卵母細胞成熟度及胚胎質量的關系

王興玲,張文娟, 蔡鵬飛,肖雅琳

鄭州大學第三附屬醫院生殖中心 鄭州 450052

卵泡液中游離DNA含量與卵母細胞成熟度及胚胎質量的關系

王興玲△,張文娟, 蔡鵬飛,肖雅琳

鄭州大學第三附屬醫院生殖中心 鄭州 450052

△女，1962年2月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：生殖內分泌與輔助生殖技術，E-mail：wangxingling2013@163.com

關鍵詞游離DNA；成熟卵泡液；未成熟卵泡液；卵母細胞成熟度；胚胎質量

摘要目的：探討卵泡液中游離DNA含量與卵母細胞成熟度及胚胎質量的關系。方法：共收集了87位患者的成熟與未成熟卵泡液。以年齡30歲為界，定義年齡<30歲的為A組，年齡≥30歲的為B組。使用DNA手工提取法(改良酚-氯仿-異丙醇法)進行卵泡液中游離DNA的提取并檢測。結果：成熟卵泡液組中游離DNA含量[(1 168.4±81.1)μg/L]低于未成熟卵泡液組[(1 875.6±95.7)μg/L]，差異有統計學意義(P<0.001)。A組可移植胚胎數目[(5.6±2.7)個]、優質胚胎數目[(3.9±1.8)個]高于B組[(4.1±2.5)和(2.5±1.6)個]，A組成熟卵泡液中游離DNA含量[(1 129.4±78.6)μg/L]低于B組[(1 214.2±56.8)μg/L]，差異均有統計學意義(P<0.001)。結論：游離DNA含量可能是評價卵泡細胞成熟度以及預測胚胎質量的指標。

卵泡液包圍著卵母細胞，參與了卵泡成熟、卵母細胞的生長和發育。因此，卵泡液中的各種成分可能是一個可靠地評估卵母細胞和胚胎結果的生物學標志物，能夠作為人類輔助生育技術(assisted reproductive technology，ART)中補充的預后診斷工具[1-2]。在卵母細胞發育和成熟的過程中，伴隨著細胞凋亡事件的發生。而且，不同的卵母細胞由于其功能和狀態的不同，在發育過程中細胞凋亡程度是不同的[1]。凋亡程度越高，卵母細胞質量越差，進而極有可能產生較差的胚胎。與婦科、胎兒疾病、癌癥等都有著極為密切關系[3-5]的游離DNA，主要是由細胞凋亡或壞死產生的[6]，是凋亡程度的反映。由此推測，卵泡液中的游離DNA含量可能與卵母細胞發育成熟度以及胚胎質量有關。該研究旨在探討卵泡液中的游離DNA是否是一個能夠預測卵母細胞成熟度及胚胎質量的指標。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年9月至12月于鄭州大學第三附屬醫院生殖中心行卵胞漿內單精子顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)助孕治療的87位患者，以年齡30歲為界，定義年齡<30歲為A組(47例)，≥30歲為B組(40例)。入選患者納入標準：年齡≤40歲，體重指數(BMI)為17～30 kg/m2，月經周期21～35 d，內分泌正常，未發現有卵巢或子宮器質性病變。剔除有多囊卵巢綜合征、反復流產史、黏膜下層肌瘤、子宮粘連、應用小劑量的阿司匹林、HPV感染等的患者。

1.2治療方法于體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)治療前1周期的黃體中期(排卵后第7天)給予短效促性腺激素釋放激素激動劑達菲林0.1 mg/d皮下注射8 d，之后改為0.05 mg/d再皮下注射8 d進行垂體降調節，后測血卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estrogen，E2)、孕激素(progestogen，P)，降調達標后(FSH<5 IU/L，P<1 μg/L，LH<5 IU/L，E2<50 ng/L)同時開始使用FSH和(或)人尿促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG)150～225 IU 超促排卵治療，期間B超監測卵泡發育，測定血清FSH、E2、LH、P水平，根據卵泡發育情況和激素水平調整用藥劑量；當直徑達16～18 mm的卵泡超過3個時停用r-FSH和HMG，注射艾澤250 mg誘發排卵，34～36 h后陰道B超引導下穿刺取卵，行ICSI對卵母細胞成熟度進行評估，然后常規受精，72 h后選擇2～3枚優質胚胎移植入子宮腔，移植前行胚胎質量評分。從取卵日開始，每天常規肌內注射黃體酮60 mg和口服地屈孕酮20 mg進行黃體支持。

1.3卵泡液游離DNA測定

1.3.1樣本處理于取卵日在B超引導下抽取卵泡中的卵泡液。對納入試驗的87位患者，每位患者在取卵時將每個帶有卵子的卵泡液單獨存放，后分離卵母細胞，每個卵子單獨置于一個培養皿，將對應卵泡液存放于4 ℃冰箱待用，同時進行卵子與卵泡液的一一對應標記。待行ICSI時，對每個卵子的成熟度進行判定，將所有評定為成熟卵子的卵泡液混勻，記為成熟卵泡卵泡液(測得游離DNA含量記為游離DNA1)；將判定為未成熟卵子的卵泡液混勻，記為未成熟卵泡液(測得游離DNA含量記為游離DNA0)。卵泡液2 000 r/min離心10 min，取清亮上清，放于-80 ℃冰箱冷凍保存。實驗時取卵泡液放于4 ℃冰箱過夜緩慢解凍，2 500g離心2 min，去除可能的組織碎片及脫落細胞，收集清澈的卵泡液進行游離DNA提取。

1.4卵泡成熟度檢測、受精及胚胎評分根據胞核、胞漿形態和極體排出情況來評判卵母細胞的成熟度。 減數分裂中期 Ⅱ(meiosis metaphase Ⅱ，MⅡ)的卵母細胞為成熟卵母細胞，表現為出現卵周隙中可見第一極體，且胞質均勻； 減數分裂中期Ⅰ(meiosis metaphase Ⅰ，MⅠ)的卵母細胞和生殖泡(germinal vesicle，GV)的卵母細胞均為未成熟卵母細胞，其中MⅠ卵母細胞胞漿內生殖泡消失，未見第一極體排出，GV 期卵母細胞有明顯的胞核但無極體。對患者配偶的精液進行梯度離心法處理，按 ICSI常規操作方案受精。ICSI 后第 1 天觀察卵子受精情況，雙原核(2PN)卵子作為正常受精卵，取卵術后第 2～3天對胚胎進行評分，按Peter卵裂期胚胎評分系統評估D3胚胎質量[7]。

1.5統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組患者基本情況、游離DNA含量以及每個患者成熟與未成熟卵泡液內的游離DNA的差異，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1兩組患者基本情況、實驗室指標及游離DNA含量的比較見表1。

表1　兩組患者間基本情況、游離DNA含量的比較

2.2每個患者成熟與未成熟卵泡液內的游離DNA配對比較結果未成熟卵泡液中游離DNA含量[(1 875.6±95.7)μg/L]高于成熟卵泡液[(1 168.4±81.1)μg/L]，t=50.595，P<0.001。

3討論

雖然最近幾年IVF-ET的臨床妊娠率已經明顯提高，2010～2011年每個周期的臨床妊娠率接近40%，但這仍然意味著在每個周期中，將近60%的女性沒有妊娠[8]。而且，將近20%的女性在3個IVF周期后仍沒有臨床妊娠。只有獲得成熟的卵子，才可能獲得優質的胚胎，才更有可能提高臨床妊娠率。所以，如何快速準確地檢測卵母細胞的成熟度以及胚胎質量尤為重要。該研究結果提示，卵泡液中的游離DNA含量可能是一個評價卵母細胞成熟度和胚胎質量優劣的指標。

該研究發現，游離DNA在卵泡液中的含量與卵泡的成熟度呈負相關，表明其與單個卵泡的功能和狀態相關。在哺乳動物中，隨著卵泡的逐漸成熟，卵泡液成分也在不斷發生著變化。研究[1]表明，豬和牛小的竇卵泡的凋亡率比大、中卵泡高，由此推測，未成熟卵泡中高水平的游離DNA可能是由于凋亡事件增多造成的。那么，卵泡液中游離DNA水平可能反映了卵泡的健康和成熟度。在取卵過程中，直徑≥15 mm的卵泡中取得的卵子并不一定是成熟的，而直徑<15 mm的卵泡中也有可能獲得成熟的卵子。這表明，憑主觀上的卵泡大小并不能很明確地說明卵子的成熟情況和卵子的質量。由此看來，卵泡液中的游離DNA可能是更為準確方便的預測卵母細胞成熟度及健康的指標。

大量的數據[9-10]表明，30歲以下不孕婦女的優質胚胎產生率明顯高于30歲以上婦女。該研究依此入手，將患者以30歲為界分組，研究結果顯示30歲以下不孕婦女的成熟卵泡液中游離DNA含量低于30歲以上婦女，所以推測，游離DNA含量可能與胚胎質量存在一定的相關性。有研究[11]表明，游離DNA可以導致凋亡和氧化應激，而凋亡事件的增多，造成卵母細胞質量及胚胎質量的降低。據此推測，年齡≥30歲的不孕婦女的可移植胚胎數、優質胚胎數較少、優胚率低的原因可能與卵泡液中游離DNA含量的增多有關。Scalici等[1]的研究也表明，卵泡液中的游離DNA含量與胚胎質量存在著負相關，這跟作者的研究結果一致。但是，該研究只提供了一個間接的可能證據，直接證據還需要大量的實驗通過實時監測單個卵子到胚胎的發育情況來更準確的說明這一結果。

究竟卵泡液中高濃度的游離DNA是造成胚胎質量較差的原因，還是結果，不得而知。最近，Hazout[12]的一個研究貌似給出了解釋，他們對一些長期不孕或者反復移植失敗的患者進行了血液和卵泡液中游離DNA的檢測，發現與健康人對比，其體液中的游離DNA水平較高，之后給予了DNase的注射治療，結局為50%的不孕婦女臨床妊娠，這個結果可能提示，環境中較高水平的游離DNA對妊娠是不利的，當降低不孕婦女體液中的游離DNA含量時，會增加其臨床妊娠的概率。由此推測，高水平的游離DNA可能是造成胚胎質量較差的原因，從而導致了不孕。但成功的妊娠是胚胎和內膜因素的共同作用，具體是單一方面或者雙方的原因還有待進一步研究。

卵泡液是取卵獲取卵母細胞吸出來的副產品，其收集是非侵入性的，所以游離DNA的量化是很容易實現的。因此，游離DNA作為一個預測卵母細胞成熟度和胚胎質量指標的應用是非常有前景的。如果可以得出準確的游離DNA與卵母細胞質量及胚胎質量的關系，那么使用脫氧核糖核酸酶來降低游離DNA含量的靶向治療將會是治療不孕的有效手段。但是，該研究樣本數目較少，還需要大量的研究來論證。

參考文獻

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(2015-09-15收稿責任編輯趙秋民)

Relationship between content of cell-free DNA and oocyte maturation and embryo quality in follicular fluid

WANGXingling，ZHANGWenjuan，CAIPengfei，XIAOYalin

ReproductiveCenter，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordscell-free DNA;mature follicular fluid;immature follicular fluid;oocyte maturation;embryo quality

AbstractAim: To explore the relationship between the content of cell-free DNA and oocyte maturation and embryo quality in follicular fluid.Methods: The mature and immature follicular fluid of 87 patients were collected. Patients with age<30 years were group A(n=47), and patients with age≥30 years were group B(n=40). The concentration of cell-free DNA was detected by manual extraction(modified phenol-chloroform-isoamyl alcohol extraction).Results: The content of cell-free DNA in the mature follicular fluid group[(1 168.4±81.1) μg/L)] was significantly lower than that in immature follicular fluid group [(1 875.6±95.7) μg/L)](P<0.001). The patients′ partial parameters such as the number of embryo numbers (5.6±2.7), good quality embryo number(3.9±1.8) in group A were significantly higher than the patients in group B[(4.1±2.5) and (2.5±1.6)]. But the content of cell-free DNA in group A [(1 129.4±78.6) μg/L)] was lower than that in group B[(1 214.2±56.8) μg/L)](P<0.001).Conclusion: The content of cell-free DNA can be used as a biological indicator to evaluate oocyte maturation, and it may also be an indicator to predict the quality of embryos.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.023

中圖分類號R711.6