重組人促紅細胞生成素對短暫性缺氧新生大鼠的神經保護作用

張梅梅，閆方方，蔣　超，孟　顏

鄭州大學第五附屬醫院兒童康復醫學科 鄭州 450052

重組人促紅細胞生成素對短暫性缺氧新生大鼠的神經保護作用

張梅梅△，閆方方，蔣超，孟顏

鄭州大學第五附屬醫院兒童康復醫學科 鄭州 450052

△女，1960年9月生，本科，主任醫師，研究方向：小兒神經病學，E-mail：mmzhang@zzu.edu.cn

關鍵詞促紅細胞生成素；缺氧缺血性腦??；新生大鼠；神經保護作用

摘要目的：探討重組人促紅細胞生成素(rhEPO)對新生大鼠缺氧缺血性腦病(HIE)的神經保護作用。方法：將7日齡雄性SD大鼠隨機分為對照組、單純缺氧組和治療組。對照組不做缺氧處理，治療組先建立短暫性腦缺氧大鼠模型，后經腹腔注射法給予rhEPO 治療，對照組和單純缺氧組于相同時間點腹腔注射等量生理鹽水。采用干-濕重法測量腦組織含水量，尼氏染色觀察海馬CA1區神經元形態學變化，Western bolt檢測海馬組織中凋亡相關蛋白cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達情況。Morris水迷宮檢測大鼠的神經行為學變化。結果：與對照組相比，單純缺氧組大鼠腦組織含水量增加，海馬CA1區退行變性神經元數目增多(P<0.001)，細胞核固縮、深染明顯；cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax表達增加(P<0.001)。治療組與單純缺氧組相比，腦組織含水量及海馬CA1區變性神經元數目明顯減少，cleaved-Caspase-3、Bax表達減少而Bcl-2表達增加(P<0.05)。單純缺氧組大鼠的學習記憶能力較對照組明顯下降，而治療組的學習記憶能力較單純缺氧組有顯著改善(P<0.001)。結論：rhEPO對HIE新生大鼠具有神經保護作用，能夠減輕急性期腦水腫及海馬神經元損傷，改善大鼠學習記憶能力。

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒期最常見的腦病，其病情重、病死率高，并可導致永久性神經功能缺陷，已成為嚴重危害新生兒健康的重要因素[1]。亞低溫治療是目前惟一有效的臨床治療方法，但其遠期神經保護效果并不明顯，因此神經保護療法仍為目前研究的熱點[2]。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)的神經保護作用已在腦損傷模型得到證實[3]，但其對HIE的神經保護作用鮮有報道。該實驗旨在探討EPO對HIE的神經保護作用，為臨床EPO的應用提供理論依據。

1對象與方法

1.1實驗動物、主要試劑與藥品健康雄性7日齡SD大鼠120只，清潔級，體重10～13 g，由河南省實驗動物中心提供；在光照、黑暗12 h交替、恒溫恒濕環境中由母鼠自由喂養。重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)(沈陽三生制藥有限公司)，兔抗鼠cleaved-Caspase-3、 Bcl-2、Bax及GAPDH抗體(美國加州圣克魯茲生物技術公司)，羊抗兔辣根過氧化物酶二抗、Western bolt試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒及超敏ECL化學發光試劑盒(中國碧云天生物技術有限公司)，甲酚紫染色液(德國Sigma生物技術公司)，其他常規試劑均為國產分析純級。

1.2模型建立及實驗分組參照Samaiya等[4]的方法建立新生大鼠窒息模型，具體如下：將7 日齡SD大鼠置于37 ℃恒溫密閉缺氧裝置中，以2.5 L/min的流量從進氣口持續輸入100%氮氣10 min，然后將大鼠置于常氧環境中恢復至蘇醒后送回母鼠身邊喂養。按隨機數表法將建模成功大鼠隨機分為單純缺氧組(n=40)、治療組(n=40)，另設對照組(n=40)不給予缺氧處理。治療組于缺氧后0、24和48 h 3個時間點分別經腹腔注射rhEPO 5 000 U/kg，對照組和單純缺氧組于相同時間點腹腔注射等量生理鹽水。

1.33組大鼠腦組織含水量測定缺氧后48及72 h，每組隨機選取8只大鼠，斷頭取腦后去除腦干和小腦，用靈敏度為0.001 g的數字天平測量其濕重，后置于58 ℃烤箱中烤至恒重，用腦含水量公式計算腦組織含水量[5]：腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.43組大鼠海馬CA1區退行變性神經元數目的尼氏染色法檢測缺氧后第7 天，每組取6只大鼠灌注取腦，將腦組織修塊后置于40 g/L多聚甲醛固定液中4 ℃過夜；梯度蔗糖脫水，冰凍切片機制備包含海馬組織的20 μm腦組織冠狀切片。切片經干燥、水洗后，置于焦油紫染色液中37 ℃染色10 min，后行分化、脫水、透明、封片等處理，于光學顯微鏡下觀察腦組織形態學變化。每只大鼠挑選3張腦片，每張腦片挑選3個高倍鏡視野，計數海馬CA1區退行變性神經元數目并計算其百分比。

1.63組大鼠行為學檢測術后4周，每組取12只大鼠進行Morris水迷宮實驗。①參考記憶實驗：共4 d，每d每只大鼠進行4次實驗，每次實驗讓大鼠分別從不同象限面朝池壁入水，大鼠找到隱藏平臺所用時間為逃避潛伏期，如果大鼠在60 s內未找到平臺，則逃避潛伏期記錄為60 s；每輪實驗結束后，允許大鼠在平臺停留10 s；每兩次實驗間隔為30 min。②探索實驗：于實驗第5天撤走平臺，隨機挑選一個入水點入水，觀察大鼠在原平臺象限停留時間及穿越原平臺的次數。在上述2個實驗中，大鼠的游泳速度被記錄，作為評判大鼠運動能力的基線。數據由Morris水迷宮自動監視系統生成。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較缺氧后不同時間點3組大鼠腦組織含水量、海馬CA1區退行變性神經元數目、海馬組織中cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達的差異，應用重復測量數據的方差分析比較3組大鼠行為學的變化，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1缺氧后不同時間點3組大鼠腦組織含水量比較見表1 。

表1　缺氧后不同時間點

*：與對照組相比，P<0.05；#：與單純缺氧組相比，P<0.05。

2.23組大鼠海馬CA1區退行變性神經元數目尼氏染色結果見圖1。對照組海馬CA1區細胞排列整齊，核固縮少見；單純缺氧組細胞排列紊亂，形態異常，核固縮、深染明顯，神經細胞變性嚴重；治療組海馬CA1區細胞核固縮、深染情況較單純缺氧組顯著改善。單純缺氧組海馬CA1區變性神經元所占百分比(56.32%±5.27%)較對照組(6.97%±1.04%)明顯增加，治療組變性神經元所占百分比(25.20%±3.05%)較單純缺氧組顯著減少(F=293.626，P<0.001)。

A：對照組；B：單純缺氧組；C:治療組。圖1　各組大鼠海馬CA1區尼氏染色結果(×400)

2.33組大鼠海馬組織中cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表達見圖2、表2。

圖2　3組大鼠海馬組織中cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表達

組別nclaved-Caspase-3Bcl-2BaxBcl-2/Bax對照組60.097±0.0401.440±0.0790.505±0.0923.800±0.898單純缺氧組61.310±0.079*3.374±0.225*4.631±0.786*0.746±0.135*治療組60.340±0.076#5.680±0.256#0.960±0.043#6.418±0.466#F525.748663.72137.906139.283P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：與對照組相比，P<0.05；#：與單純缺氧組相比，P<0.05。

2.43組大鼠行為學檢測結果見表3、4。與對照

組相比，單純缺氧組的逃避潛伏期明顯延長，平臺象限停留時間及穿越原始平臺次數減少，表現出顯著的認知功能缺損；而與單純缺氧組相比，治療組的逃避潛伏期明顯縮短，平臺象限停留時間及穿越原始平臺次數增加，認知功能明顯改善。各組間游泳速度差異無統計學意義(P>0.05)。

表3　Morris水迷宮

逃避潛伏期：F組間=205.795，P<0.001；F時間=279.989，P<0.001；F交互=3.653，P=0.003。*：與對照組相比，P<0.05；#：與單純缺氧組相比，P<0.05。游泳速度：F組間=1.170，P=0.323；F時間=2.925，P=0.097；F交互=0.180，P=0.836。

表4　Morris水迷宮探索實驗結果

*：與對照組相比，P<0.05；#：與單純缺氧組相比，P<0.05。

3討論

HIE的發病率及死亡率高，其中約25%的存活患兒可產生智力障礙、癲癇、腦性癱瘓等神經系統后遺癥[2]。EPO是一種活性糖蛋白，因其促紅細胞生成作用被應用于貧血的治療。近二十年來，EPO的非造血作用逐漸被闡明[3,6-7]。研究[8-9]表明，EPO受體在皮質、海馬等腦組織、膠質細胞、神經元、內皮細胞中均有表達，且表達量受缺氧刺激調控。

EPO的神經保護作用雖已在腦損傷模型中得到證實[10-11]，但仍缺乏EPO對于HIE保護作用的研究。故作者選用Samaiya等[4]的方法，造成新生大鼠全腦彌漫性損傷，模擬臨床HIE的病理變化過程，探究EPO的神經保護作用。

高劑量EPO全身應用可通過未成熟及缺氧損傷腦組織的血腦屏障發揮神經保護作用，該實驗采用一種有效的給藥方法[12]，即高劑量rhEPO(5 000 U/kg)連續3 d腹腔給藥，以提高通過血腦屏障的EPO含量。腦組織含水量測定結果證實rhEPO應用能顯著減輕缺氧后急性期腦水腫。

HIE的主要病理改變為缺氧造成的急、慢性腦損傷，故該實驗選擇對缺氧敏感且與學習記憶能力密切相關的海馬作為研究對象。尼氏染色結果顯示rhEPO能夠減輕缺氧對神經元造成的損傷。Morris水迷宮結果表明rhEPO治療可明顯改善后期大鼠的學習記憶能力。

Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2和Bax的比值是決定細胞存亡的關鍵。半胱天冬酶家族(Caspases)是哺乳動物細胞凋亡的啟動者和執行者，其中Caspase-3是凋亡執行者中最關鍵的蛋白酶，而Caspase-3的激活是Bax誘導的細胞凋亡的必經步驟[13-14]。該研究通過Western blot檢測表明：缺氧處理能夠增加促凋亡蛋白的表達；而rhEPO干預后，抗凋亡蛋白表達顯著增加而促凋亡蛋白表達減少，從蛋白水平證明了rhEPO具有一定的抗凋亡作用。

總之，該實驗通過對缺氧損傷急性期腦組織含水量、病理學改變、凋亡相關蛋白及后期行為學表現的研究，證實了EPO的神經保護作用，為EPO神經保護研究提供了新的實驗依據，而有關合適的臨床給藥途徑、給藥劑量及全身大劑量應用后的并發癥等問題仍有待進一步探究。

參考文獻

[1]MARTINEZ-BIARGE M,DIEZ-SEBASTIAN J,WUSTHOFF CJ,et al.Antepartum and intrapartum factors preceding neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy[J].Pediatrics,2013,132(4):e952

[2]ZUBCEVIC S,HELJIC S,CATIBUSIC F,et al.Neurodevelopmental follow up after therapeutic hypothermia for perinatal asphyxia[J].Med Arch,2015,69(6):362

[3]RANGARAJAN V,JUUL SE.Erythropoietin: emerging role of erythropoietin in neonatal neuroprotection[J].Pediatr Neurol,2014,51(4):481

[4]SAMAIYA PK,KRISHNAMURTHY S.Characterization of mitochondrial bioenergetics in neonatal anoxic model of rats[J].J Bioenerg Biomembr,2015,47(3):217

[5]何遠宏,李魁,王建平,等.骨髓單個核細胞移植對腦出血大鼠的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,02(2):264

[6]TORUN YA,OZDEMIR MA,ULGER HA,et al.Erythropoietin improves brain development in short-term hypoxia in rat embryo cultures[J].Brain Dev,2014,36(10):864

[7]JUUL SE,FERRIERO DM.Pharmacologic neuroprotective strategies in neonatal brain injury[J].Clin Perinatol,2014,41(1):119

[8]WANG L,DI L,NOGUCHI CT.Erythropoietin, a novel versatile player regulating energy metabolism beyond the erythroid system[J].Int J Biol Sci,2014,10(8):921

[10]WANG L,WANG X,SU H,et al.Recombinant human erythropoietin improves the neurofunctional recovery of rats following traumatic brain injury via an increase in circulating endothelial progenitor cells[J].Transl Stroke Res,2015,6(1):50

[11]徐發林,郭佳佳,王彩紅,等.不同時機應用促紅細胞生成素對感染所致新生大鼠腦損傷的保護作用[J].中華實用兒科臨床雜志,2014,29(17):1325

[13]WU N,LI W,SHU W,et al.Protective effect of picroside Ⅱ on myocardial ischemia reperfusion injury in rats[J].Drug Des Devel Ther,2014,8:545

[14]WEI P,ZHIYU C,XU T,et al.Antitumor effect and apoptosis induction of Alocasia cucullata (Lour.) G. Don in human gastric cancer cells in vitro and in vivo[J].BMC Complement Altern Med,2015,15:33

(2015-10-12收稿責任編輯趙秋民)

Neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin for transient cerebral hypoxia neonatal rats

ZHANGMeimei，YANFangfang，JIANGChao，MENGYan

DepartmentofPediatricNeurology，theFifthAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordserythropoietin；hypoxic-ischemia encephalopathy；neonatal rat；neuroprotective effect

AbstractAim: To explore the neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin (rhEPO) for hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE) in neonatal rats.Methods: Seven-day-old SD neonatal rats were randomly allocated into three groups: control group, anoxia group and rhEPO treatment group. The control group did not undergo anoxia. After the establishment of anoxia model, the rhEPO treatment group received rhEPO by intraperitoneal injection. Neonatal rats in control group and anoxia group received the treatment with the same volume of normal saline at the same time point. Brain water content(BWC) was estimated by dry-wet method；morphological changes in neurons of hippocampus CA1 area were observed by Nissl staining；apoptosis-related proteins such as cleaved-Caspase-3, Bcl-2 and Bax were measured by Western bolt. Neurological behavior was assessed by Morris water maze test(MWM).Results: Compared with control group, the BWC as well as the number of denatured neurons of hippocampus CA1 area in anoxia group was significantly increased(P<0.001); the nucleus pycnosis and hyperchromasia were evidently seen. In addition, the expressions of cleaved-Caspase-3, Bcl-2 and Bax in anoxia group were significantly increased compared with those of control group(P<0.001). Compared with anoxia group, the BWC, the number of denatured neurons of hippocampus CA1 area and expressions of cleaved-Caspase-3 and Bax in rhEPO treatment group were significantly decreased, while the expression of Bcl-2 was significantly increased (P<0.05). The ability of learning and memory in anoxia group was significantly decreased compared with control group, while the ability of learning and memory in rhEPO treatment group was significantly improved compared with anoxia group(P<0.001).Conclusion: RhEPO has neuroprotective effect by reducing acute brain edema, alleviating injury of neurons in hippocampus and improving the neurological behavior of neonatal rats with HIE.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.025

中圖分類號R722